一种新鲜组织保存液及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物样本保存，涉及一种新鲜组织保存液及其制备方法和应用。背景技术：1、获得新鲜、状态良好的离体组织，是开展单细胞测序的关键前期步骤。但人体组织在被从供体取出后，在将其一直到受体中之前，包括在运输过程中有很多不可控因素，导致离体组织在运输过程中变质，细胞活性降低，核酸降解甚至全部细胞死亡。此外，单细胞测序接收的离体组织类型多样，尤其包括很多不常见的组织类型或特殊状态的组织类型，如胎盘组织、血管组织、子宫内膜组织、罕见癌种的癌组织、罕见疾病的病灶组织、类器官、pdx模型等，这些组织类型常常包含一些特殊细胞类型，脆弱、易凋亡，所需营养成分特殊。而目前常用的离体组织保存液缺乏相应的成分，所以对这些包含特殊细胞类型的保存效果不佳，无法满足后续单细胞测序实验的需要。2、因此，亟需一种能够保护各类罕见细胞类型的新鲜组织保存液。技术实现思路1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种新鲜组织保存液及其制备方法和应用，能够广泛适用于多种组织类型，并更好地保护罕见组织中的各种细胞类型，为后续生物学发现奠定基础。2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：3、第一方面，本发明提供了一种新鲜组织保存液，所述新鲜组织保存液包括：基础培养基、细胞合成代谢营养物、抗氧化剂、抗细胞凋亡剂、细胞保护剂、抗生素、细胞生长因子和代谢调节剂；所述细胞保护剂包括海藻糖、羟乙基淀粉、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠和聚甘油脂肪酸酯。4、本发明的新鲜组织保存液能够减少细胞坏死和细胞凋亡，更好地维持组织细胞的活性，能够保护罕见组织类型和组织样本中的罕见细胞类型极大程度上减少低温状态下的细胞损伤和凋亡，使新鲜组织在离体环境下能够进行更久的低温运输和保存，而不发生变质和核酸降解。5、优选地，所述细胞合成代谢营养物包括人血清、小鼠血清、n2、b27、bdnf、ultroserg或核苷中的任意一种或至少两种的组合。6、优选地，所述人血清在所述新鲜组织保存液中的体积百分比为5％-15％。7、上述5％-15％中的具体点值可以选择5％、6％、7％、8％、10％、13％、14％、15％等。8、优选地，所述小鼠血清在所述新鲜组织保存液中的体积百分比为5％-15％。9、上述5％-15％中的具体点值可以选择5％、6％、7％、8％、10％、13％、14％、15％等。10、优选地，所述n2在所述新鲜组织保存液中的体积百分比为0.1％-1％。11、上述0.1％-1％中的具体点值可以选择0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等。12、优选地，所述b27在所述新鲜组织保存液中的体积百分比为0.5％-2％。13、上述0.5％-2％中的具体点值可以选择0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、1％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％等。14、优选地，所述bdnf在所述新鲜组织保存液中的浓度为1-20mg/l。15、上述1-20mg/l中的具体点值可以选择1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l、10mg/l、14mg/l、18mg/l、19mg/l、20mg/l等。16、优选地，所述ultroser g在所述新鲜组织保存液中的浓度为1-20g/l。17、上述1-20g/l中的具体点值可以选择1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、10g/l、14g/l、18g/l、19g/l、20g/l等。18、优选地，所述核苷在所述新鲜组织保存液中的浓度为10-50mg/l。19、上述10-50mg/l中的具体点值可以选择10mg/l、12mg/l、13mg/l、14mg/l、15mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、45mg/l、50mg/l等。20、优选地，所述核苷的来源包括腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷或胸苷中的任意一种或至少两种的组合。21、优选地，所述抗氧化剂包括半胱氨酰甘氨酸、维生素c、α-硫辛酸或mito-tempo中的任意一种或至少两种的组合。22、优选地，所述半胱氨酰甘氨酸在所述新鲜组织保存液中的浓度为10-50mg/l。23、上述10-50mg/l中的具体点值可以选择10mg/l、12mg/l、13mg/l、14mg/l、15mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、45mg/l、50mg/l等。24、优选地，所述维生素c在所述新鲜组织保存液中的浓度为250-1000mg/l。25、上述250-1000mg/l中的具体点值可以选择250mg/l、251mg/l、252mg/l、253mg/l、260mg/l、300mg/l、400mg/l、600mg/l、800mg/l、900mg/l、995mg/l、998mg/l、1000mg/l等。26、优选地，所述α-硫辛酸在所述新鲜组织保存液中的浓度为0.2-0.6mm/l。27、上述0.2-0.6mm/l中的具体点值可以选择0.2mm/l、0.3mm/l、0.4mm/l、0.4mm/l、0.5mm/l、0.6mm/l等。28、优选地，所述mito-tempo在所述新鲜组织保存液中的浓度为50-200μm/l。29、上述50-200μm/l中的具体点值可以选择50μm/l、51μm/l、53μm/l、60μm/l、80μm/l、100μm/l、140μm/l、160μm/l、180μm/l、190μm/l、198μm/l、100μm/l等。30、优选地，所述抗细胞凋亡剂包括y-27632、ac-devd-cho或z-lehd-fmk中的任意一种或至少两种的组合。31、优选地，所述抗生素包括青链霉素双抗。32、优选地，所述细胞生长因子包括bfgf、nt3、pdgf-bb、egf或gdf11中的任意一种或至少两种的组合。33、优选地，所述代谢调节剂包括chir99021和/或ripk1抑制剂。34、优选地，所述ripk1抑制剂的来源包括necrostatin-1和/或necrostatin-1s。35、优选地，所述新鲜组织保存液ph为7.2-7.6。36、上述7.2-7.6中的具体点值可以选择7.2、7.3、7.4、7.5、7.6等。37、第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的新鲜组织保存液的方法，所述方法包括：38、将细胞合成代谢营养物、抗氧化剂、抗细胞凋亡剂、细胞保护剂、抗生素、细胞生长因子和代谢调节剂混合均质，使用基础培养基进行定容，定容后调节ph至7.2-7.6。39、第三方面，本发明提供了第一方面所述的新鲜组织保存液在保存新鲜组织中的应用。40、优选地，所述新鲜组织包括心、脑、肾、肝、肺、胃、肠、脾、胎盘组织、血管组织、子宫内膜组织、肿瘤组织、皮肤组织、类器官或pdx模型中的任意一种。41、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：42、(1)本发明的新鲜组织保存液，除常规抗氧化剂外，额外添加了线粒体靶向抗氧化剂mito-tempo，具有清除超氧化物和烷基自由基的特性，有助于防止线粒体氧化，从而减少细胞坏死和细胞凋亡，更好地维持组织细胞的活性；43、(2)本发明的新鲜组织保存液能够更好的保护罕见组织类型和组织样本中的罕见细胞类型，如抗细胞凋亡剂和代谢调节剂成分能够更好地保护肝脏等易坏死组织，细胞合成代谢营养物中的n2、b27、bdnf等成分能够更好地保护组织中的神经细胞，多种细胞生长因子能够更好地保护干细胞、神经胶质细胞、肿瘤细胞等特殊细胞类型；44、(3)本发明的新鲜组织保存液能够极大程度上减少低温状态下的细胞损伤和凋亡，使新鲜组织在离体环境下能够进行更久的低温运输和保存，而不发生变质和核酸降解。