一种大花序桉的组培快繁方法与流程

本发明属于植物培养领域，涉及大花序桉无性繁殖育苗方法，尤其涉及大花序桉的组培快繁方法。背景技术：1、大花序桉，也叫昆士兰桉，为桃金娘科桉树属树种，其拉丁学名为eucalyptuscloeziana。大花序桉树高通常为35～40m，在天然林中可达45m，在最好的立地上大花序桉达到它的最大高度40～55m，直径约2m。大花序桉生长迅速，干形通直、圆满，自然整枝良好，开花结实早，花期长，从花芽形成至成熟果实约需16个月。该树种具有较强的萌芽能力，其木材黄褐色，纹理通直，结构均匀，沉重，硬度高，耐久。是一种很好的锯材，广泛用于矿柱、建筑、家具、坑木等。2、大花序桉自然分布区不连续分布，各分布区的种源遗传距离较远，个体差异显著，不同个体组培获得成功的概率不同。受限于组培快繁技术的突破，该树种良种一直未被推广种植。专利号为201510976324.3的发明专利公开了一种大花序桉的组培快繁方法，该方法采用大花序桉优良家系的优良单株，伐倒后促生萌芽，利用萌芽作为外植体，以带有潜伏芽的茎段离体诱导无菌芽，无菌芽的获得，不经过愈伤组织成苗途径，而直接由外植体茎段萌生侧芽或不定芽，经过无菌芽进行继代增值培养、生根培养和生根苗移栽，获得再生植株。该方法采用伐倒促萌获得外植体，大花序桉伐桩萌芽率不足20％且个体差异大，伐桩容易造成大花序桉优良种质的损失。该方法大花序桉总生根率虽在72.8％以上，但移栽成活率仅70％左右，损失近30％的生根瓶苗。技术实现思路1、本发明为了克服上述现有技术不足，提供一种能有效保留大花序桉优良种质并高效开发无性系，提高组培生根率和移栽成活率的大花序桉的组培快繁方法。2、本发明采用的技术方案如下：3、一种大花序桉的组培快繁方法，选择无病虫害的大花序桉优良单株进行环割促萌，当萌芽条长至1.5～2.0m时，剪取木质化枝条进行嫁接，当嫁接茎段萌芽条长至20～25cm时，剪取半木质化茎段获取外植体并进行外植体消毒处理，按顺序依次进行诱导培养、继代培养、生根培养ⅰ和生根培养ⅱ，最后将生根完全、苗高4-6cm的生根瓶苗洗净培养基并移栽至装有基质的营养杯内；4、主要步骤包括：5、(1)环割促萌6、选择无病虫害的大花序桉优良单株，铲除周围杂灌，于环割前一天喷洒1％高锰酸钾消毒，在离地20cm处环割树周长3/4，宽度3cm，刮尽形成层至韧皮部，喷洒促萌营养液至韧皮部，环割后第五天、第十天在树干周围喷洒75％酒精消毒；7、(2)萌芽条嫁接8、当萌芽条长至1.5～2.0m时，剪取木质化枝条进行嫁接；9、(3)外植体消毒10、当嫁接茎段萌芽条长至20～25cm时，剪取半木质化茎段，用洗衣粉溶液洗涤5min，再用自来水冲洗5min；带至超净工作台，切成2～3cm、1～2个潜伏芽的小段放入无菌瓶，75％酒精浸泡30s，无菌水清洗3次，体积浓度2％次氯酸钠浸泡2min，无菌水清洗3次；11、(4)诱导培养12、用灭菌滤纸吸干步骤(3)处理后的小段的表面水分，切除小段两端，接种至诱导培养基，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度1500-2000lux条件下培养20-25天；13、(5)继代培养14、切取步骤(4)获得的无菌芽转入继代培养基，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度2000-2500lux条件下培养20-25天；15、(6)生根培养ⅰ16、当经步骤(5)继代培养获得的芽苗长至3-4cm，切取芽苗转入生根培养基ⅰ，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度1500-2000lux条件下培养10-15天；17、(7)生根培养ⅱ18、当经步骤(6)培养获得的芽苗根部长出的根状突起长至1.0-1.5cm时，将芽苗移至生根培养基ⅱ，在温度25±2℃，光照强度2000-5000lux的自然光条件下培养10-15天；19、(8)移栽20、将生根完全、苗高4-6cm的生根瓶苗洗净培养基并移栽至装有基质的营养杯内，淋透基质，覆盖薄膜保湿并盖上遮荫网，5天后喷洒甲基托布津防病害，10天后打开遮荫网和薄膜，每10天喷洒一次叶面营养液。21、优选的，以上步骤(2)所述的嫁接的方法为：22、嫁接时间：春季、晴天；23、砧木选择：高25～35cm，杆径2.5～5mm，大花序桉，于离地高10cm进行嫁接；24、穗条选择：长20～22cm，杆径2.5～5mm，带4～8个腋芽、木质化大花序桉枝条；25、嫁接前用医用封口膜包缠穗条，嫁接时将穗条两面削成“v”状,从砧木嫁接位置中间切一条2～3cm长的切口，将穗条插入砧木，用封口膜包扎；26、将嫁接苗移入温室大棚，保持大棚湿度80％,温度26±2℃，当新叶到成熟叶大小一半时，移至透光度为50％的遮阴网下培育，当新叶到成熟叶片大小时，全光照培育。27、优选的，以上步骤(1)所述的促萌营养液的原料组分为：1l促萌营养液含190mgkno3、165mgnh4no3、17mgkh2po4、44mgcacl2、37mgmgso4、0.1mgn6苄基腺嘌呤(6-ba)、0.2mg萘乙酸(naa)。28、优选的，以上步骤(4)所述的诱导培养基的原料组分为：1l诱导培养基含1800mgkno3、360mgnh4no3、270mgkh2po4、200mgcacl2、360mgmgso4、10mgh3bo3、25mgmnso4、10mgznso4、0.25mgna2moo4、0.025mgcuso4、0.025mgcocl2、0.83mgki、1000mgpvp、0.24mg生物素(vh)、100mgl-半胱氨酸、2.4mgd-泛酸钙(vb5)、2mg甘氨酸、5mg烟酸(vb3)、2mg硫胺素(vb1)、0.5mg吡哆素(vb6)、37.3mg na2-edta、27.8mg feso4、100mg肌醇、0.3-0.5mgn6苄基腺嘌呤(6-ba)、0.1-0.2mg萘乙酸(naa)、30g蔗糖、5g琼脂粉、ph值5.8～6。29、优选的，以上步骤(5)所述的继代培养基的原料组分为为：1l继代培养基含1900mgkno3、1650mgnh4no3、170mgkh2po4、440mgcacl2、370mgmgso4、6.2mgh3bo3、25mgmnso4、10mgznso4、0.25mgna2moo4、0.025mgcuso4、0.025mgcocl2、0.83mgki、0.24mg生物素(vh)、2mg甘氨酸、5mg烟酸(vb3)、2mg硫胺素(vb1)、0.5mg吡哆素(vb6)、37.3mg na2-edta、27.8mgfeso4、100mg肌醇、0.4-0.6mgn6苄基腺嘌呤(6-ba)、0.2-0.3mg萘乙酸(naa)、30g蔗糖、5g琼脂粉、ph值5.8～6。30、优选的，以上步骤(6)所述生根培养基ⅰ的原料组分为为：1l生根培养基ⅰ含950mgkno3、825mgnh4no3、85mgkh2po4、220mgcacl2、185mgmgso4、6.2mgh3bo3、25mgmnso4、10mgznso4、0.25mgna2moo4、0.025mgcuso4、0.025mgcocl2、0.83mgki、0.24mg生物素(vh)、100mgl-半胱氨酸、2.4mgd-泛酸钙(vb5)、2mg甘氨酸、5mg烟酸(vb3)、2mg硫胺素(vb1)、0.5mg吡哆素(vb6)、37.3mg na2-edta、27.8mg feso4、100mg肌醇、0.5-0.8mg吲哚丁酸(iba)、0.1-0.2mg萘乙酸(naa)、30g蔗糖、5g琼脂粉、ph值5.8～6。31、优选的，以上步骤(7)所述生根培养基ⅱ的原料组分为为：1l生根培养基ⅱ含950mgkno3、825mgnh4no3、85mgkh2po4、220mgcacl2、185mgmgso4、6.2mgh3bo3、25mgmnso4、10mgznso4、0.25mgna2moo4、0.025mgcuso4、0.025mgcocl2、0.83mgki、0.24mg生物素(vh)、100mgl-半胱氨酸、2.4mgd-泛酸钙(vb5)、2mg甘氨酸、5mg烟酸(vb3)、2mg硫胺素(vb1)、0.5mg吡哆素(vb6)、37.3mg na2-edta、27.8mg feso4、100mg肌醇、0.1-0.3mg吲哚丁酸(iba)、0.1-0.2mg萘乙酸(naa)、0.5-0.mg8多效唑(pp333)、30g蔗糖、5g琼脂粉、5g活性炭、ph值5.8～6。32、优选的，以上步骤(8)所述的基质为：椰糠:泥炭土:黄心土按重量比为6:2:2混合均匀制成，移栽前用体积浓度为0.5％高猛酸钾溶液对营养杯进行消毒；所述的叶面营养液的原料组分为：1l叶面营养液含190mgkno3、165mgnh4no3、17mgkh2po4、44mgcacl2、37mgmgso4、0.62mgh3bo3、2.5mgmnso4、1mgznso4、0.025mgna2moo4、0.0025mgcuso4、0.0025mgcocl2、0.083mgki。33、优选的，以上步骤(1)所述的优良单株为大花序桉gec4-138品种。大花序桉gec4-138品种是经广西壮族自治区林木品种审定委员会审定的林木良种，具有适应性强、生长快，干形通直，以及木材基本密度大、坚硬、干缩性小，抗弯、抗压性强等优良特性，造林半年后平均成活率达95.5％，林龄8.4年时，平均胸径可达20.0cm，平均树高可达21.4m，单株材积可达0.3057m3。34、本发明具有的优点及有益效果如下：35、1、本发明嫁接后再取外植体，嫁接苗在苗圃地，方便采集且容易控制病虫害和污染问题，保证外植体材料生长活力；且嫁接苗可不断提供外植体，诱导次数和时间不受限制；避免了取直接环割后萌芽条作为外植体材料存在的搬运至组培基地路途长，诱导难度大，诱导率低，单次诱导成功难的问题，为大花序桉优良种质资源的保存以及后期无性系的培育奠定了基础。36、2、本发明针对大花序桉直接生根效率较低，瓶内生根率仅50％左右的现状，采用二步生根培养法，两次连续的生根培养采用不同的培养基和置于不同的培养环境，利用生根培养基ⅰ诱导根源基生成，尤其是使用高浓度的iba配合低浓度的naa使大花序桉根状突起，即发育不完全根的诱导率达98％以上；生根培养基ⅱ添加pp333，降低iba浓度，添加活性炭并在自然光条件下培养有利于大花序桉根状突起生长并发育完全，最终瓶内生根率达95％以上。37、3、本发明在移栽时选用特定的基质和叶面营养液，保证了大花序按生长、成活所需的营养全面、足量，有效提高大花序按组培苗移栽成活率，移栽成活率可达90％以上，减少材料损失，可促进大花序桉规模化生产。38、4、本发明采用的环割促萌方式获取材料，而非伐桩萌芽方法，避免了伐桩容易造成大花序桉优良种质的损失，能有效保留大花序桉优良种质的同时实现大花序桉无性系高效开发。