一种福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法

本发明属于贝类育种，具体涉及一种福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法。背景技术：1、与二倍体相比，三倍体贝类生长速度较快。此外，因其不育性，使其在生殖周期不消耗糖原、脂质等营养成分产生配子，因此能够保证全年供应市场并且口感更好、风味更佳。自从stanley等(1981)首次利用药物成功诱导三倍体美洲牡蛎c.virginica后，许多学者对三倍体贝类做了大量的研究，如香港巨牡蛎，长牡蛎和福建牡蛎。虽然可以通过物理或化学方式(如细胞松弛素b，cb、6-二甲基氨基嘌呤，6-dmap、温度、低渗和咖啡因等)处理二倍体受精卵获得三倍体。但上述方法常导致三倍体率极其不稳定、成活率低。直至guo和allen(1994)开发了一种培育可存活的四倍体长牡蛎的方法并通过四倍体与二倍体杂交的方式成功获得100％的三倍体子代。之后，许多研究学者开展了不同贝类四倍体培育。2、尽管牡蛎多倍体育种已经开展多年，但实现产业化的多倍体牡蛎品种却寥寥无几，最主要的原因在于四倍体亲贝培育难度大。目前可以通过三种方式诱导四倍体:(1)抑制二倍体与二倍体的受精卵的极体排放；(2)抑制雄性二倍体与雌性三倍体的受精卵的极体排放；(3)抑制雌性二倍体与雄性四倍体的受精卵的极体排放。虽然通过方法(2)诱导四倍体率高于方法(1)和方法(3)。但处理时机和持续处理时长难以把握，常导致四倍体率低、成活率不高。因此，需要高效、操作稳定性高的诱导方法。技术实现思路1、本发明为解决传统四倍体贝类诱导方法中存在的诱导率低、倍性不稳定且死亡率高等缺点，开发了一种以受精卵发育阶段作为生物学指标的时间定量处理方法；通过本方法培育的四倍体倍性稳定、四倍体率高、生长良好，可以为四倍体福建牡蛎优良品种的培育及三倍体福建牡蛎工厂化生产提供理论和实践基础。2、本发明的福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：3、a、精选三倍体母本：使用流式细胞仪检测倍性后，称重并根据湿重挑选前10％壳型美观、活力强的个体；解剖并在光学显微镜下区分性别，将卵量≥1500万个、卵子发育整齐且卵黄颜色深的个体保留作为三倍体母本；4、b、获取三倍体卵子：采用“干剥法”获取单个牡蛎的卵子，以保证配子的同步发育性；经500目筛绢网洗去杂质后放置在水温为25℃，盐度为28psu的海水中熟化40min；待卵子完全变圆后，再次使用500目筛绢网洗卵3次；熟化完成后取少量卵放置在50ml玻璃烧杯中定义为对照组，将剩余卵定义为处理组；5、c、精选二倍体父本：根据湿重挑选前10％的二倍体福建牡蛎；解剖并在光学显微镜下区分性别，将精子活力旺盛、性腺饱满的个体保留作为二倍体父本；6、d、获取二倍体精子：待步骤a中的三倍体卵子总数90％以上熟化完成时，采用“干剥法”获取单个牡蛎的精子，并在海水中活化3-5min；活化完成后取少量精子放置在50ml玻璃烧杯中定义为对照组，剩余精子定义为处理组；7、e、实验处理：首先将对照组的精子和卵子按照精卵比8-10：1的比例混合并开始计时；将对照组开始受精至受精卵第一个第一极体出现的这一时间段定义为a；将对照组受精卵第一个第一极体出现至50％的受精卵出现第一极体的时间段定义为b；待对照组受精10min后，将处理组按照精卵比8-10：1的比例受精并开始计时；受精时间为(a-3)时，利用0.75mg/l的细胞松弛素b诱导处理组，持续诱导b时长；8、f、幼虫及稚贝养成：诱导完成后，洗去受精卵液中的细胞松弛素b，放置在水泥池中孵化，采用常规方法培育幼虫，附着变态完成后转移到海上养成；9、g、倍性检测：对于步骤c中获得的幼虫采用流式细胞仪检测倍性；通过血淋巴和鳃的双重倍性检测完成成贝倍性分析。10、所获幼虫孵化率高、存活率高、保持四倍体率高的同时也能保持倍性稳定；所获稚贝在海上养成阶段，其生长速度快、存活率高、四倍体率高并且稳定。11、本发明不同于传统四倍体牡蛎诱导方法，存在的主要创新点如下：(1)精子、卵子获得方式不同：传统方法通过手挤及海水冲洗、过滤的方式获得精子和卵子；而本发明采用“干剥法”获得精子和卵子后，再同时将其分别放置到海水中，最大限度保证其水化时间。(2)交配方式不同：传统方法混合多只牡蛎的精子和卵子用于诱导四倍体，其配子发育同步性难以保证；而本发明在精选、优选精子和卵子的基础上，通过一对一单对牡蛎受精，配子发育状况良好且同步性极高，有效避免了因环境或者牡蛎的个体差异等因素导致配子发育不同步等问题。(3)诱导时机和持续诱导时间不同：传统方法采用受精8-10min后，利用诱导剂持续处理15-20min，诱导时机和持续诱导时间固定，导致在不同环境中诱导的牡蛎其四倍体率变化较大，且四倍体率不稳定；而本发明将对照组开始受精至第一个第一极体出现的时间段定义为a，将对照组受精卵第一个第一极体出现至50％的受精卵出现第一极体的时间段定义为b，在处理组受精时长为(a-3)时，加入0.75mg/l的细胞松弛素b持续处理b时长，本发明以受精卵的发育状况作为生物学指标，有效避免了因固定诱导时间导致的诱导率低且不稳定等问题。(4)子代表现不同：传统方法获得的四倍体幼虫存活率低于20％，四倍体率低于50％；而本发明四倍体幼虫存活率在28％以上，幼虫四倍体率在70％以上，360日龄时，成贝四倍体率在90％以上。12、本发明通过精选福建牡蛎三倍体母本和二倍体父本、优选精子和卵子、采用一对一单对牡蛎受精的方式、以受精卵发育阶段为生物学指标开发了一种福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法，可获得存活率高、四倍体率高且倍性稳定的福建牡蛎四倍体；本发明通过精选亲本、优选精卵，“干剥法”获取精卵、单对受精的方式获得受精卵，极大限度地保障了配子发育的同步性，有效消除了传统多对牡蛎精卵混合导致的配子同步性差的缺陷；本发明不同于传统的诱导方法(受精8-10min后，使用试剂持续处理15-20min)，采用受精卵的发育状况作为生物学指标，将对照组开始受精至第一个第一极体出现的时间段定义为a，将对照组受精卵第一个第一极体出现至50％的受精卵出现第一极体的时间段定义为b，在处理组受精时长为(a-3)时，加入0.75mg/l的细胞松弛素b持续处理b时长，有效避免了因固定诱导时间导致的诱导率低且不稳定等问题；培育出的幼虫和成贝的四倍体率高且稳定；本发明为福建牡蛎四倍体育种提供了新思路；本发明具有操作简便，高效易行等优点。技术特征：1.一种福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：2.根据权利要求1所述的一种福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法，其特征在于：步骤(a)中，所述父、母本为壳型美观，活力好且无损伤的，称量所有父、母本，分别选取湿重前10％的个体。3.根据权利要求1所述的一种福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法，其特征在于：步骤(b)中，优选发育整齐、卵子数量≥1500万个、卵黄颜色深的个体作为母本。4.根据权利要求1所述的一种福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法，其特征在于：步骤(b)中，优选性腺饱满、精子活力旺盛的个体作为父本，采用“干剥法”获取精子和卵子。5.根据权利要求1所述的一种福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法，其特征在于：步骤(d)和(e)中，受精方式采用一对一单对受精，在此期间温度控制在20-25℃，盐度控制在25psu，控制每个卵子周围有5-8个精子，受精卵密度控制在≤15000个/ml；孵化和幼虫培育期间，温度控制在25℃，盐度控制在25-30psu。技术总结本发明以受精卵发育阶段为生物学指标开发了一种福建牡蛎四倍体时间点定量诱导方法。本发明通过优选精卵、“干剥法”获取精卵、单对受精等方式有效消除了传统多对牡蛎精卵混合导致配子同步性差等缺陷。本发明不同于传统方法（受精8‑10 min后，使用试剂持续处理15‑20 min），采用受精卵的发育状况为生物学指标，将对照组开始受精至受精卵第一个第一极体（PB1）出现的时间段定义为A，将对照组受精卵第一个PB1出现时至50%的受精卵发育PB1的时间段定义为B，待处理组受精时长为（A‑3）时，加入诱导剂持续处理B时长，有效避免了因固定诱导时间导致的诱导率低且不稳定等问题。本发明培育的福建牡蛎至成贝阶段四倍体率高且稳定，为福建牡蛎多倍体育种提供了新思路。技术研发人员：李琪,梁园鑫受保护的技术使用者：中国海洋大学技术研发日：技术公布日：2024/5/19