一种无精浆精子玻璃化冻存的冷冻液、配套载体

本发明涉及辅助生殖，特别是涉及一种无精浆精子玻璃化冻存的冷冻液、配套载体及方法。背景技术：1、精子冷冻是男性生育力保存的一种有效方法，目前临床上冷冻精子最常用的方法是液氮熏蒸法(慢速冷冻)，即将液化后的精子与精子冻存液1：1(v/v)混匀，装在毛细管中水平悬挂在液氮上方5～10cm处熏蒸30min，然后再将其转移至液氮中长期保存。这种方法多用于精液量多，精子活力高的患者，而且操作步骤繁琐，精子暴露时间长，冷冻效果有限，复苏后精子的存活率为60％～80％，但该方法对于少精、弱精症患者几乎不适用。且现有的冷冻液多数对精子有渗透和毒性损伤，影响其后续受精能力。技术实现思路1、为了解决上述问题，本发明提供了一种无精浆精子玻璃化冻存的冷冻液、配套载体及方法。本发明提供的冷冻液不仅降低了对精子的有渗透和毒性损伤，保护了精子的生物学功能，而且利用本发明的冷冻液进行的玻璃化冷冻，具有操作简单，复苏后精子存活率高的优势，适用于单精子或少量精子冻存。2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：3、本发明提供了一种无精浆精子玻璃化冻存的冷冻液，包括以下组分：基础液、冷冻保护剂、白蛋白和硫酸庆大霉素；所述基础液包括以下组分：氯化钠75.07～110.12mm、氯化钾5.43～8.40mm、硫酸镁0.94～1.33mm、磷酸二氢钾0.14～0.36mm、氯化钙1.66～2.47mm、碳酸氢钠3.35～4.68mm、依地酸二钠0.02～0.06mm、4-羟乙基哌嗪乙磺酸20.05～28.12mm、丙酮酸钠0.24～0.41mm、柠檬酸钠0.48～1.24mm、乳酸钠14.55～20.04mm和葡萄糖0.35～0.75mm；4、所述冷冻保护剂为非渗透性保护剂，包括非渗透性的糖和聚乙烯吡咯烷酮k30；所述非渗透性的糖在冷冻液中的浓度为0.2～0.5m；所述聚乙烯吡咯烷酮k30在冷冻液中的质量浓度为1％～3％；5、所述白蛋白在冷冻液中的浓度为4～12g/l；所述硫酸庆大霉素在冷冻液中的浓度为8～12mg/l。6、优选的，所述非渗透性的糖包括果糖、海藻糖和葡聚糖中的一种或多种；所述白蛋白包括人血清白蛋白、人血清替代物和重组人血白蛋白中的一种或多种；所述冷冻液的ph为7.2～7.5，渗透压为620～1100mosm/kg。7、本发明提供了一种用于无精浆玻璃化冷冻的配套载体，包括无精浆精子筛选皿；8、所述无精浆精子筛选皿包括皿底104和配套的皿盖105；所述皿底104上设置有第一凹坑106、第二凹坑107和第三凹坑108；所述第一凹坑106和第二凹坑107由第一通道109连通；所述第一通道109的宽度为50～100μm，高宽比为0.8～1.2：1；所述第一通道109的最低点高于所述第一凹坑106和第二凹坑107的最低点；所述第二凹坑107和第三凹坑108由第二通道110连通；所述第二通道110的宽度为5～20μm，高宽比为0.8～1.2：1；所述第二通道110的最低点高于所述第二凹坑107和第三凹坑108的最低点；所述第一通道109和所述第二通道110的两端均设置开关；9、所述第一凹坑106用于放置含有精浆的精液；所述第一凹坑107用于放置精子获能液；所述第三凹坑108用于放置上述技术方案所述的冷冻液。10、优选的，所述无精浆精子筛选皿还包括：信息标记区102和手持区103；所述信息标记区102的一端和所述皿底104连接，另一端和所述手持区103连接。11、优选的，所述配套载体还包括装载含有精子的冷冻液的装置；所述装置包括第一装置或第二装置；12、所述第一装置包括载体201和第一吸取装置202；所述载体201上设置微流体通道203和第一过滤网204；所述第一过滤网204的一面和所述微流体通道203连接，另一面和所述第一吸取装置202连接；13、所述第二装置包括毛细管302、包裹所述毛细管302的支撑件301、第二过滤网304和第二吸取装置303；所述第二过滤网304的一面和所述毛细管302连接，另一面和所述第二吸取装置303连接。14、优选的，所述微流体通道203的宽度为5～20μm，高宽比为0.8～1.2：1；所述毛细管302的内径为5～10μm；所述过滤网204的孔径≤0.45μm；所述过滤网304的孔径≤0.45μm。15、本发明提供了一种无精浆精子的玻璃化冷冻方法，包括以下步骤：16、将精液去除精浆后，与上述技术方案所述的冷冻液混合，在液氮中保存。17、优选的，包括以下步骤：18、所述去除精浆和与冷冻液混合采用无精浆精子筛选皿进行，在第三凹坑108中得到无精浆精子与冷冻液的混合液；所述无精浆精子筛选皿为上述技术方案所述配套载体中的无精浆精子筛选皿。19、优选的，得到无精浆精子与冷冻液的混合液后，将所述混合液装载，放入液氮中保存；所述装载的装置包括上述技术方案所述配套载体中的第一装置或第二装置；20、当所述装置为第一装置时，所述装载的方法包括：将所述微流体通道203未和第一过滤网204连接的一端与所述第三凹坑108中的混合液接触，通过虹吸作用将所述混合液吸入到所述微流体通道203内，打开所述第一吸取装置202吸取所述混合液中多余的液体，保留无精浆精子和少量液体；21、当所述装置为第二装置时，所述装载的方法包括：将所述毛细管302未和第二过滤网304连接的一端与所述第三凹坑108中的混合液接触，通过虹吸作用将所述混合液吸入到所述毛细管302内，打开所述第二吸取装置303吸取所述混合液中多余的液体，保留无精浆精子和少量液体。22、优选的，第二凹坑107中放置的所述精子获能液包括以下组分：氯化钠80～120mm、氯化钾4.4～6.6mm、硫酸镁0.8～1.2mm、磷酸二氢钠0.4～0.6mm、氯化钙1.3～2.2mm、碳酸氢钠3.2～4.8mm、hepes16.8～25.2mm、丙酮酸钠0.26～0.38mm、乳酸钠12.5～18.7mm、葡萄糖2.22～3.30mm、果糖2.20～3.30mm、谷氨酰胺0.4～0.6mm、甘氨酸0.08～0.12mm、丙氨酸0.08～0.12mm mm、天冬酰胺0.08～0.12mm mm、天冬氨酸0.08～0.12mm mm、谷氨酸0.08～0.12mm mm、脯氨酸0.08～0.12mm mm、丝氨酸0.08～0.12mm mm、牛磺酸0.08～0.12mm mm、人血白蛋白4～6g/l和硫酸庆大霉素8～12mg/l。23、有益效果：24、本发明提供的冷冻液中的非渗透性物质(糖类、pvp)作为无精浆精子玻璃化冷冻液的重要组分，在适度增加溶液渗透压的同时提高了溶液粘度，克服了传统渗透性冷冻保护剂对精子形态和功能的渗透损伤和毒性损伤；而且非渗透性保护剂中的聚乙烯吡咯烷酮k30(pvp k30)是一种大分子物质，可以提高溶液的粘度，在冷冻液加载过程中，会跟从胞内渗出的水分发生水合作用，减少胞内的未冻水份额，从而减小在降温过程中胞内外发生冰晶损伤的概率，有利于无精浆精子的玻璃化冻存。由实验结果可知，采用本发明的冷冻液，精子在冷冻后，不论是复温后精子活力，还是精子质膜、顶体的完整性均要显著高于市售冷冻液；利用本发明的冷冻液对无精浆精子进行玻璃化冷冻的效果要优于慢速冷冻，而且操作简单便捷。25、进一步的，本发明提供的配套载体中的无精浆精子筛选皿，通过微流控技术将精液液化、精子获能、无精浆精子筛选及收集等功能集成在了一起，极大地解决了精子处理的一系列繁琐操作，使无精浆精子获取更加简单便捷，为少量、微量精子的高质量玻璃化冻存提供了可能，能够最大限度的筛选出高活力、高质量的精子。26、进一步的，本发明提供的配套载体中的装置，通过吸附装置尽量去除微流体通道内的溶液，能够最大限度地提高无精浆精子玻璃化冷冻的存活率及保护精子功能；而且第二装置选择一个毛细管进行精子冷冻，不仅能够提高无精浆精子玻璃化冻存的效果，更重要的是解冻后可以直接进行卵母细胞icsi(intracytoplasmic sperminjection)受精操作，避免了少量精子在解冻后二次处理中的丢失或损伤。