一种大鼠急性肺损伤模型的构建方法与流程

本发明属于儿童疾病动物模型构建领域，具体涉及一种大鼠急性肺损伤模型的构建方法。背景技术：1、急性肺损伤及其严重形式急性呼吸窘迫综合征是以急性发作、难治性低氧血症、肺水肿及上皮损伤为特征的非心源性呼吸衰竭，典型病理改变为弥漫性炎性损伤、呼吸膜和血管等组织结构破坏。目前急性肺损伤的临床治疗主要以机械通气为主，缺乏特异的药物治疗，病死率高达35％-46％。急性肺损伤临床表现为喘、满、昏、热，其中尤以喘、满表现更甚，多数医家将其归属于中医学“暴喘”范畴，包括“喘促”和“喘脱”。急性肺损伤时，急性全身性炎症反应可引起微血管损伤，使肺血管和上皮的通透性增加，蛋白质和富含炎性细胞的液体流入肺泡腔，导致非心源性肺水肿，气体交换肺泡-毛细血管减少，进而导致低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征。临床表现为明显低氧血症、双侧弥漫性肺浸润、肺水肿和肺顺应性下降等。病理变化包括肺泡毛细血管屏障损坏引起的血管通透性增加、肺泡出血、纤维蛋白沉积。2、急性肺损伤是临床常见急危重症，是由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。临床上以急性进行性加重的呼吸困难、呼吸窘迫、难治性低氧血症和非心源性肺水肿为早期表现，虽然近年来在气道管理和保护机械通气策略等方面有长足进步，但因其病因及发病机制错综复杂，迄今尚未完全阐明，急性肺损伤致病环节众多且缺乏针对性治疗措施，破坏性极大，严重影响重症医学住院患者的生存质量和预后，所以急性肺损伤导致的死亡病例居高不下，因此急性肺损伤成为临床危重病学科的研究热点和难点。急性肺损伤及更严重的急性呼吸窘迫综合征是临床危重症发生急性呼吸衰竭的主要原因，其发病原因多样，可将其病因归类为两类，包括肺内因素和肺外因素，肺内因素包括：(1)化学性因素，如吸入烟尘、纳米颗粒及氧中毒等；(2)物理性因素，如肺挫伤及放射性损伤等；(3)生物性因素，如重症肺炎。肺外因素包括严重休克、感染中毒症、严重非胸部创伤、重度烧伤、大量输血、急性胰腺炎及药物中毒等，其中感染占主要地位。3、许多研究已经评估了各种治疗方式的疗效，但合理、有效地建立急性肺损伤动物模型是有效开展这些研究的前提，体内模型的建立是研究疾病发生发展、病因机制、防治效果及疾病预后的重要手段。急性肺损伤体内模型是基于临床中常见的致病因素而设计，大多具备一项或多项人类急性肺损伤的特征；其次急性肺损伤体内模型是建立在哺乳动物体内，其种类包括大鼠、家兔及灵长类动物，其中啮齿类的小鼠或大鼠繁殖快、价格低廉和来源容易，因而广泛运用，但人类与动物的肺在解剖结构和生理功能上不完全相同，对急性损伤性刺激的反应亦不同，对肺损伤的评价产生很大的影响，急性肺损伤模型的建立方式及影响因素较多，所以目前体内模型都未能完全复制出人类急性肺损伤的所有特征。目前常用的造模方法包括：内毒素法，易观察炎症反应的变化，易重复，但肺泡毛细血管通透性变化不明显。油酸法，易重复，适合模拟脂肪栓塞引起的肺损伤，但不能模拟脓毒血症引起的肺损伤，较难操作。高氧法，易重复，但难操作。机械通气法，易观察肺通气功能的变化，但临床意义大难操作。病原体法，易观察炎症反应的变化，更有针对性，易重复，但物种差异性大。烟雾法，易重复，需要合适的实验设备，但难操作。盲肠结扎和穿刺法，易观察炎症反应和肺泡毛细血管通透性的变化，但需要合适的实验设备，难操作。4、病理生理学实验以动物实验为主，采取何种动物是决定实验成功与否的一种重要因素。一般针对实验目的，根据实验动物的生物学特征以及复制动物疾病模型的经验选择实验动物品种。目前根据我国实验动物的使用情况和国外文献报道的常使用实验动物，最常用的实验动物品种为：小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬等，其中，小鼠是最常用的实验动物品种。其品系多，可供选用的范围广，性周期短，生育能力强，价廉，加之对小鼠的生物学特性比较了解，遗传学研究深入且广泛，实验积累资料丰富，因此为科研工作者所乐用。在研究肺损伤发病机制及临床治疗肺损伤的药物开发过程中，伦理和研究经费等问题很大程度上限制了研究在患者或大型哺乳动物中进行，但目前科研人员构建或改良肺损伤模型时常使用大鼠作为实验动物。因此，成功构建小鼠肺损伤模型对肺损伤相关研究而言至关重要。既往构建肺损伤动物模型主要分为有创与无创。有创即通过外科手术暴露气管的方法制备，如王婷等通过分离暴露气管，插管后经支气管滴注内毒素溶液构建急性肺损伤模型，具体地，将成年sd大鼠分为正常组、气管滴注lps(lps-it)组及假手术组(sham)，每组十只。正常组不进行任何干预。lps-it组使用水合氯醛腹腔注射麻醉后(8％，1ml)，将大鼠固定，分离暴露气管，插管，经支气管缓慢滴注内毒素溶液5mg/kg(100μl)，缝合伤口；sham组同lps-it组插管后，气管滴注生理盐水100μl。在造模24h后，腹主动脉取血至死，取出完整的肺，结扎右肺，进行后续分析。但对于小鼠构建的动物模型来说，有创方式具有以下缺点：(1)具有侵入性，术中难以控制感染风险，并且需对小鼠进行深度麻醉，小鼠在术中及术后死亡率高；(2)当滴入颗粒性悬液时易于阻塞大气管引起动物窒息死亡：(3)滴入溶液容易使液体在两侧肺重分布不均匀。因此，采用小鼠进行造模的成功率与死亡率较难保障，从而影响实验可重复性。还有科研人员使用滴鼻的方法构建模型(如中国专利cn201910793141.6)，但此方法通过鼻腔给药，有文献报道大部分药物会滞留于鼻腔中，导致进入肺内的药物明显减少，从而影响药物对肺损伤的作用强度，且样本之间进入药物的量也不稳定，会影响实验稳定性。以上方法仍存在存在造模不稳定、成功率不高等缺点。因此，我们提出一种操作简便且过程易控、成本较低、可靠稳定的大鼠急性肺损伤模型构建方法。技术实现思路1、本发明旨在开发一种能够重点针对急性肺损伤的核心症状，能够很好的进行急性肺损伤的药效评价的动物模型。本发明构建的大鼠急性肺损伤模型在诱发急性损伤经典症状(呼吸困难、肺组织水肿和肺组织纤维化等)，以及精神沉郁、肺泡萎缩、肺泡炎性浸润、血氧降低等急性肺损伤伴随症状上均表现出较高的成功率和稳定性。本研究可为急性肺损伤药效的评价提供可靠的动物模型，其具有成本较低、模型稳定、操作简便、无创伤等优点。2、本发明是通过以下技术方案实现的：3、一种大鼠急性肺损伤模型的构建方法，其特征在于，包括以下歩骤：4、(1)、腹腔注射：选4周龄sd大鼠，spf级条件下饲养，适应性饲养两周后开始造模；造模总时间为四周；造模开始后，向所述大鼠腹腔注射胆酸、以及聚乙二醇和聚山梨醇酯混合液，每两天注射一次，每次注射时先向大鼠腹腔注射胆酸，30分钟后再腹腔注射聚乙二醇和聚山梨醇酯混合液，所述胆酸用dmso溶解，再用生理盐水稀释，使其终浓度为1mmol/l，每次的胆酸注射剂量为0.01mmol/kg体重；所述聚乙二醇和聚山梨醇酯混合液由聚乙二醇和聚山梨醇酯溶于生理盐水制备而成，所述聚乙二醇和聚山梨醇酯的注射剂量分别为80-100μg/kg、100-120μg/kg体重。5、(2)、热应激：造模开始一周后，每天将所述大鼠放置在38±1℃的高温培养箱内4h，共持续7天。6、(3)、二氧化硅摄入：造模开始两周后，在大鼠的常规饲料中添加二氧化硅，一直持续到造模结束；所述二氧化硅的添加量为常规饲料重量的3％.7、(4)、运动诱导：造模开始三周后，利用宠物跑轮玩具使大鼠每天至少运动2小时，所述宠物跑轮玩具采用食物引诱，持续运动一周，即得到大鼠急性肺损伤模型。8、四周建模结束后，通过对大鼠一般体征观察、肺组织he染色、肺湿干质量比值测定、elisa检测肺组织炎症因子含量和氧化自由基相关指标、肺功能检测、胸部x线片、观察肺组织的大体改变、动脉血氧分压及氧合指数检测、肺组织中aqp4和p-nf-κb、na+-k+-atpaseα1蛋白表达等方面对模型进行评价，结果表明，大鼠出现了典型的肺损伤症状，符合急性肺损伤动物模型可靠性和有效性的判定，即疾病的发病原因、症状表现、病理生理，按照本发明的构建方法，能够成功获得大鼠急性肺损伤模型。9、本发明的技术方案，具有如下优点：10、1、本发明的大鼠急性肺损伤模型的构建方法中，通对动物腹腔注射胆酸、以及聚乙二醇和聚山梨醇酯混合液+热应激+二氧化硅摄入+运动诱导得到大鼠急性肺损伤模型，这种非单因素诱导的急性肺损伤动物模型与病因学上认为急性肺损伤是多因素诱导发生相符，能够更好地模拟人类急性肺损伤的特征。本发明非单因素诱导的急性肺损伤动物模型，基本上符合三种有效性，无论是从病理生理理论角度，还是模拟典型临床症状和治疗预测角度，都是较为理想的动物模型，将为急性肺损伤的多因素诱导发病机制提供支持，并为开发急性肺损伤治疗的新方案提供理论依据。11、2、本发明构建的急性肺损伤动物模型效果稳定，个体差异小；多因素之间相互协同，构建的疾病模型更为准确。该模型在诱发急性肺损伤经典症状(呼吸困难、肺组织水肿和肺组织纤维化等)，以及精神沉郁、肺泡萎缩、肺泡炎性浸润、血氧降低等急性肺损伤伴随症状上均表现出较高的成功率和稳定性。12、3、本发明的急性肺损伤动物模型，为非单因素诱导的急性肺损伤动物模型，将为急性肺损伤的多因素诱导发病机制提供支持，以及更好地模拟人类急性肺损伤的优势，为开发一种有效治疗急性肺损伤的新药物制剂提供重要的理论依据。不但可用于探究多因素对急性肺损伤的科学内涵，还能对新药的筛选提供能反应疾病本质的动物模型。13、4、本发明采用了腹腔注射胆酸、以及聚乙二醇和聚山梨醇酯混合液的诱导方式。胆酸是一种重要的致炎因子，腹腔注射胆酸可一定程度上诱导动物的肺损伤；聚乙二醇和聚山梨醇酯混合液能够增强磷酸化信号转导子和转录激活因子3的表达，可通过调节jak2/stat3信号传导加重胆酸诱导的炎症损伤。腹腔注射胆酸半小时后注射聚乙二醇和聚山梨醇酯混合液，使得聚乙二醇和聚山梨醇酯能够相互协同，共同辅助胆酸来诱导大鼠肺损伤，三种试剂的前后配合大大优化了对于大鼠肺损伤的诱导作用，有利于大鼠急性肺损伤模型的构建。本发明在腹腔注射药剂开始一周后，对大鼠进行了为期一周的热应激，进一步刺激大鼠肺部，大大巩固了腹腔注射的诱导效果，同时也进一步加剧了大鼠肺部的病理变化。14、5、本发明采用了在大鼠的常规饲料中添加二氧化硅的诱导方式。造模后期在大鼠的常规饲料中添加适量的二氧化硅，可在一定呈上加重大鼠肺部的炎症反应。二氧化硅是一种外源性炎症诱导剂，能够增强肺部炎症反应，加剧肺部的炎症症状；通过促进炎症介质的释放，如炎性细胞因子和白细胞介素等，加重肺部炎症反应。本发明在造模的最后一周对大鼠进行了运动诱导，在氧化硅加剧肺部炎症反应后，紧接着的运动诱导可较大程度上提高大鼠肺部的敏感性和加剧大鼠肺部的病理反应，进一步诱导其向肺组织水肿、纤维化发展。建模的最后一周的运动诱导，在本研究中起到了画龙点睛的作用，保证了效果稳定的急性肺损伤动物模型。15、本研究可为深入解析宿主患急性肺损伤后的肺部免疫机制以及评价治疗新方法提供良好的理论支撑和模型参考。研究团队对该模型进行了多次重复验证，结果可靠，并已利用该模型对多种药物进行了药效评价，验证了模型的应用价值。该动物模型表现出急性肺损伤的典型特征：呼吸困难，肺组织水肿和肺组织纤维化等。该模型可用于急性肺损伤相关领域的基础研究，为探索急性肺损伤的致病机理奠定实验动物基础。本研究可为急性肺损伤药效的评价提供可靠的动物模型，其具有成本较低、模型稳定、操作简便、无创伤等优点。