一种促进天贵卷瓣兰种子快速成苗的培养基及方

本发明涉及植物生物技术和植物栽培，具体涉及一种促进天贵卷瓣兰种子快速成苗的培养基及方法。背景技术：1、天贵卷瓣兰(bulbophyllum tianguii)是兰科(orchi天aceae)石豆兰属(bulbophyllum thouars)附生草本植物，一般生长于海拔700-1300米的喀斯特峡谷崖壁、林下岩石、山顶岩石或腐殖树茎上，目前仅分布于中国广西乐业县雅长兰科植物国家自然保护区和天贵的望谟、修文、开阳、息烽等地。天贵卷瓣兰花色艳丽，花形奇特，姿态优美典雅，具有很高的观赏和药用价值。由于天贵卷瓣兰自然繁殖速率低且近年来人为采挖破坏严重，现已被列入《国家重点保护野生植物名录》二级保护植物和《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》(iucn)易危(vu)物种。2、石豆兰属植物大都处于野生状态，亟待开发。有关石豆兰属植物组培快繁方面的研究相对较少，李洪林等(2007)利用茎段诱导了广东石豆兰(b.kwangtungense)的组培快繁技术，繁殖系数2-3倍/50天；黄崇成等(2019)用假鳞茎和嫩芽为外植体获得一种野生石豆兰(bulbophyllum sp.)的无菌材料，培养60天后增殖系数达到2.9；王晓峰等(2017)也利用嫩芽建立了直唇卷瓣兰(b.delitescens)组培快繁方法。这些研究虽然诱导出了无菌材料，但由于外植体为野外取样，而且存在内生真菌，致使普遍存在污染率高、诱导率低的问题，浪费了较多野生资源。利用种子进行无菌播种已成功建立了多种兰科植物的工厂化快繁技术体系，如白及、铁皮石斛、建兰等，在短期内获得大量幼苗，是现阶段经济有效的快速繁殖方法。但石豆兰属无菌播种的报道仅有田海娟等(2022)利用两种石豆兰的杂交种子建立了无菌播种技术体系。天贵卷瓣兰是郎楷永和罗敦于2007年报道的一新种，分株繁殖不但繁殖速度慢，而且繁殖系数低，不利于规模化和产业化推广，而且破坏资源。因此，建立天贵卷瓣兰无菌播种快繁技术，工厂化繁殖优质种苗，不仅能够有效保护这一珍贵资源，也将为开发利用提供种苗和奠定基础。技术实现思路1、本发明所要解决的技术问题是提供一种促进天贵卷瓣兰种子快速成苗的培养基及方法。本发明目的是以天贵卷瓣兰异株异花授粉的种子为外植体，构建无菌播种培养体系，快速、高效的获得大量天贵卷瓣兰的种苗。2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：3、第一方面，一种促进天贵卷瓣兰种子快速成苗的培养基，所述的培养基包括原球茎诱导培养基、丛生芽分化培养基、丛生芽增殖培养基和生根壮苗培养基；4、所述原球茎诱导培养基包括如下用量的组分：ms基础培养基、1.0-2.0mg/l的6-ba、100-200ml/l的椰汁、0.1mg/l的naa、0-30g/l的蔗糖和0-7g/l琼脂，ph值为5.4-5.8；5、所述丛生芽分化培养基包括如下用量的组分：b5基础培养基，0-0.2mg/l的iba、0.5-1.0mg/l的agno3、0-30g/l的蔗糖和0-7g/l琼脂，ph值为5.4-5.8；6、所述丛生芽增殖培养基包括如下用量的组分：ms基础培养基、1.0-3.0mg/l的6-ba、0.1-0.5mg/l的kt、0.1-0.2mg/l的naa、50-100g/l香蕉泥、0-30g/l的蔗糖、0-1.0g/l的活性炭和0-7g/l琼脂，ph为5.4-5.8；7、所述生根壮苗培养基包括如下用量的组分：ms基础培养基、0.2-1.0mg/l的6-ba、0.1-0.5mg/l的kt、0.1-0.5mg/l的naa、100-200ml/l的椰汁(也可以采用香蕉泥)、0-30g/l的蔗糖、0-1.0g/l的活性炭和0-7g/l琼脂，ph为5.4-5.8。8、进一步，所述原球茎诱导培养基包括如下用量的组分：ms基础培养基、2.0mg/l的6-ba、200ml/l的椰汁、0.1mg/l的naa、30g/l的蔗糖和7g/l琼脂，ph值为5.4-5.8；9、所述丛生芽分化培养基包括如下用量的组分：b5基础培养基，0.2mg/l的iba、1.0mg/l的agno3、30g/l的蔗糖和7g/l琼脂，ph值为5.4-5.8；10、所述丛生芽增殖培养基包括如下用量的组分：ms基础培养基、2.0mg/l的6-ba、0.5mg/l的kt、0.2mg/l的naa、100g/l香蕉泥、30g/l的蔗糖、1.0g/l的活性炭和7g/l琼脂，ph为5.4-5.8；11、所述生根壮苗培养基包括如下用量的组分：ms基础培养基、1.0mg/l的6-ba、0.2mg/l的kt、0.5mg/l的naa、200ml/l的椰汁、30g/l的蔗糖、1.0g/l的活性炭和7g/l琼脂，ph为5.4-5.8。12、第二方面，一种促进天贵卷瓣兰种子快速成苗的培养方法，包括如下具体的步骤：13、(1)无菌播种及原球茎诱导：将未开裂成熟的天贵卷瓣兰蒴果消毒后，取出种子，接种于诱导种子萌发的所述的原球茎诱导培养基，置于组培室暗培养7-23天(d)，例如7、10、15、20、23天等等，后进行光照培养40-70天，例如40、45、50、55、60、65、70天等等，得到萌发的种子；14、(2)丛生芽分化培养：将所述萌发的种子转移到所述的丛生芽分化培养基，光照培养120-150天，例如120、125、130、145、150天等等，至诱导长出丛生芽，具体的可以是1片叶子、高0.5-1.5cm的丛生芽；15、(3)丛生芽增殖培养：将所述丛生芽转接到所述的丛生芽增殖培养基中，进行光照培养90-120天，例如90、100、110、120天等等，得到增殖的丛生芽(高度约2-3cm的丛生芽)；16、(4)丛生芽生根壮苗培养：将所述增殖的丛生芽转接到所述的生根壮苗培养基，进行光照培养90-120天，例如90、100、110、120天等等，得到生根的试管苗。17、进一步，步骤(1)中，所述天贵卷瓣兰蒴果为人工异株异花授粉的蒴果。采用人工异株异花授粉，种子萌发率高。其中，天贵卷瓣兰蒴果的获得：于晴天上午9：00-11:00，选择开花2-5天的花朵，用消毒的牙签蘸取花药后，接种到另外一株花朵的柱头上，完成授粉，套袋，标记。生长7-10个月后，待蒴果果荚表明呈淡黄色后采取，置于4℃，备用。天贵卷瓣兰蒴果消毒的具体步骤为：先用洗洁精清洗蒴果的表面，自来水冲洗干净，置于超净工作台上，然后用75％v/v酒精浸泡1min，接着用无菌水冲洗1次，再用1‰的hgcl2浸泡10min，然后用无菌水冲洗5次。采用该消毒方法，消毒灭菌的效果好。18、进一步，步骤(1)中组培室暗培养的条件为：温度为25±2℃，用遮光布遮光，光照培养的条件为：温度为25±2℃，强度为1000-1500lux，例如1000、1100、1200、1300、1400、1500lux等等，光照的时间为8-14h/天，例如8、9、10、11、12、13、14h/天；19、步骤(2)至(4)中，所述光照培养的条件为：温度为25±2℃，强度均为1000-1500lux，光照时间为8-14h/天，例如8、9、10、11、12、13、14h/天。20、进一步，所述生根的试管苗还包括以下培养步骤：21、(5)移栽驯化：将所述生根试管苗移出培养室，进行炼苗7-23天，例如7、10、15、20、23天等等，再种植到移栽基质中，得到移栽驯化苗；22、(6)栽培管理：对所述移栽驯化苗进行栽培管理。23、进一步，炼苗以散光为主，光照强度为1000-1500lx，温度为15-25℃，湿度为60～80％。24、进一步，步骤(5)中种植到移栽基质的时间为每年的3-5月，或9-11月；所述移栽基质包括泥炭土、树皮、苔藓珍、珠岩、蛭石中的至少两种。所述移栽基质需经甲基托布津粉剂600倍稀释液消毒。25、进一步，所述移栽基质包括体积比为1:1:1的泥炭土：树皮：苔藓，体积比为1:1:1的树皮：珍珠岩：蛭石，体积比为1:1的树皮：苔藓，体积比为2:1的蛭石：珍珠岩＝2:1，体积比为1:1的泥炭土：珍珠岩：蛭石中的任意一种。26、进一步，步骤(6)中栽培管理包括施肥、控制水分以及遮阴。27、进一步，步骤(6)中栽培管理具体包括：所述移栽驯化苗于移栽25-35天后，例如25、27、30、32、35天等等，喷施0.02-0.05mg/l的brs和0.5-1g/l的花宝1号的混合液，每间隔7-23天喷施一次，例如7、10、15、20、23天等等，连续至少喷施3次；在生长季每间隔8-12天喷施100-200倍的兰灵王(微生物菌剂)一次；全年的光照强度为1000-2000lux；夏季温度保持15℃-25℃，冬季自然越冬，移栽基质保持湿润。28、本发明的原理说明：29、ms基础培养基的主要特点是硝酸盐、钾和铵的含量高，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。ms固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于种子萌发以及胚、茎段、茎尖及花药的诱导培养。30、b5基础培养基的主要特点是含有较低的铵，不容易对培养物的生长产生抑制作用，有利于丛生芽的分化培养。31、6-ba，即6-(n-苄基)氨基嘌呤，又称为6-苄基氨基嘌呤。是第一个人工合成的细胞分裂素。具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用于组培培养中。32、naa，即1-萘乙酸。易溶于有机溶剂，是植物生长调节剂中的生长素类似物，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，常用语生产商用促根粉或促根剂，被广泛应用于植物插扦繁殖中。33、kt，即6-糠氨基嘌呤、激动素，是一种嘌呤类的天然植物内源激素，也是人类发现的第一个细胞分裂素。主要促进细胞分裂，提高产量，促进卵髓细胞和植物细胞的分裂。它不仅为幼胚的生长和发育不可缺少，而且对某些植物的单性生殖、刺激果实与谷粒的长大、防止衰老等都有明显效果。34、iba，即吲哚丁酸，是一种广谱的吲哚类植物生长调节剂，适应范围广泛而且安全，是一种良好的生根剂。iba与naa是两种常用的插枝生根的植物生长调节剂，其中以吲哚丁酸效果最好，因它在植物体内运转较少，容易保留在使用部位附近。iba促进生根作用强，但产生的不定根细而长，而naa的促根作用是根少而粗，因此，将两者混合使用，往往可获得更好的效果。35、br，油菜素内酯，是一种新型植物内源激素，是第一个被分离出的具有活性的油菜素甾族化合物(brassinosteroids，brs)，是国际上公认为活性最高的高效、广谱、无毒的植物生长激素。植物生理学家认为，它能充分激发植物内在潜能，促进作物生长和增加作物产量，提高作物的耐冷性，提高作物的抗病、抗盐能力，使作物的耐逆性增强，可减轻除草剂对作物的药害。36、花宝1号，hyponex no.1，均衡氮磷钾配方，氮磷钾三要素含量为7:6:19，提供所有植物自育苗、成长、至开花结果全期所需营养。花宝5号，hyponexno.5，是一种高氮配方，氮磷钾三要素含量为30:10:10，促进各类幼苗快速成长，广泛应用于促进各种国兰及洋兰新芽的快速成长。37、agno3，在植物离体培养中，分化培养基中添加agno3可明显促进愈伤组织器官发生及体细胞胚胎发生，促进一些再生困难种芽的产生，能够增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频率。38、椰汁，是一种有机附加物，含有多种氨基酸，如赖氨酸、旦氨酸，维生素等，在植物组织培养时，是用来提供营养，以促进组织培养活性。39、香蕉泥：是一种有机附加物，可以稳定ph有利于壮苗。含有大量的糖类，可为植物组织细胞分裂分化提供能源；香蕉中含有植物激素，比如细胞分裂素，生长素，乙烯和赤霉素。40、兰灵王：属于微生物菌剂，主要成分包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、哈茨木霉菌、乳酸菌、固氮菌、放线菌等多种有益微生物及其各种分泌性孢外酶类。具有提高抗病性和催芽催花的作用。41、本发明诱导种子萌发的原球茎诱导培养基中，ms为基础培养基，6-ba和naa是有利于促进种子的萌发和细胞分裂的植物激素，椰汁有利于提供一些微量元素。可以极大促进种子萌发和原球茎的诱导。将消毒后的天贵卷瓣兰蒴果，接种于该原球茎诱导培养基配方中，进行暗培养，种子逐渐变绿，再经过光照培养，膨大形成原球茎。42、本发明丛生芽分化培养基中，筛选出b5为最佳基础培养基，该培养基配方具有低盐特点，有利于丛生芽的分化培养，iba有利于丛生芽的分化和发育，agno3具有刺激分化的作用。43、本发明的丛生芽增殖培养基中，ms为基础培养基，6-ba、kt和naa促进细胞的分裂和丛生芽的生长，香蕉有利于促进丛生芽生长发育，活性炭吸附生长中产生的有害物质。培养后丛生芽增殖系数达到6.67；试管苗叶片呈深绿色，丛生芽生长好。44、本发明的生根壮苗培养基中，ms为基础培养基，6-ba和kt促进丛生芽的生长，naa促进丛生芽的生根，椰汁促进壮苗，活性炭吸附生长中产生的有害物质以及壮苗生根。可以极大促进生根壮苗，培养后试管苗叶片呈深绿色，生根率100％，生根数达到6.91条，根长达到3.15cm，根系健壮、茎粗壮、叶片浓绿、苗高。45、本发明的移栽驯化中，本发明的最佳移栽基质为蛭石：珍珠岩按体积比2:1组成的混合物，移栽成活率达100％；种苗质量整齐，质量好。本发明的移栽驯化过程中喷施0.02mg/l的brs和1.0g/l花宝1号混合液3次；每隔10d喷施一次200倍的兰灵王(微生物菌剂)。效果最好，种苗质量最好。46、本发明的有益效果：47、(1)本发明首次以天贵卷瓣兰异株异花授粉的种子为外植体，经过消毒后进行无菌播种，构建无菌播种体系，诱导原球茎的形成，促使种子萌发快、萌发率高，克服了以鳞茎或嫩芽为外植体浪费材料及诱导率低的弊端，同时提高了生产效率，降低了生产成本。48、(2)本发明建立了一种利用天贵卷瓣兰种子快速繁殖其种苗的方法及其培养基，包括种子的获得、种子播前处理、播种及原球茎诱导、丛生芽诱导培养、丛生芽增殖培养、丛生芽生根壮苗培养以及移栽驯化步骤；采用本发明方法繁殖天贵卷瓣兰种苗，种子萌发率高、萌发快；丛生芽分化快、整齐度高；丛生芽增殖系数达到6.67/120d；生根率100％，生根数6.91条，根长3.15cm，根系健壮、茎粗壮、叶片浓绿、苗高；移栽成活率100％，长势旺盛；具有繁殖速度快、产量大、种苗质量优、需时短、实际操作性强等特点，能在较短时间内获得大量天贵卷瓣兰种苗，对天贵卷瓣兰种质资源保护和可持续利用具有重要意义，应用前景非常广阔。49、(3)本发明建立了天贵卷瓣兰移栽驯化技术体系，移栽成活率高达100％；建立了移栽驯化管理中结合施用植物生长调节剂油菜素内酯brs、花宝1号以及微生物菌剂兰灵王的施用方法和施用浓度，促进了驯化苗的生长发育，提高了植株抗逆性。50、(4)本发明的方法简单，操作容易，市场前景广阔，适合规模化推广应用。