一种鲤科鱼类卵巢保存及复苏方法

本发明涉及低温生物，具体涉及一种鲤科鱼类卵巢保存及复苏方法。背景技术：1、鲤科是鱼类中最大的一科，有200多属，2000多种，分布很广，在中国淡水鱼类组成中，鲤科鱼类占一半以上。这些鲤科鱼类中含有重要的经济鱼类、观赏性鱼类及濒危的物种。鱼类卵巢组织的超低温保存，可以不间断地提供卵母细胞或性腺体细胞用于遗传学研究，使这些技术的开展不受时间及地点的限制，并为经济鱼类和观赏鱼类的品种选育提供材料。此外，冷冻卵巢组织也保存了鱼类基因，实现了珍稀或特有鱼类遗传种质资源的长期保存。同时，离体卵巢组织经过合适的方法冻存后，是可以保留体外培养与增殖能力的。但是，当前鱼类卵巢组织冻存技术存在的一个难题是，目前的冻存技术中使用到的冷冻液组分及冷冻程序复杂，且复苏后的卵巢组织的细胞活性不稳定，体外增殖能力较差，目前还没有一种稳定的冻存和复苏方法，尤其是针对鲤科鱼类卵巢组织的冷冻和复苏。技术实现思路1、本发明目的在于提供一种鲤科鱼类卵巢组织超低温保存及复苏的方法。该方法条件要求低，容易实现，经冷冻及复苏后的卵巢细胞活力高，且具有优异的体外增殖能力。2、本发明第二个目的在于提供上述用于鲤科鱼类卵巢组织超低温冷冻保存的冷冻液。3、本发明的第三个目的在于提供上述用于鲤科鱼类卵巢组织超低温冷冻保存后复苏的解冻液。4、本发明目的通过如下技术方案实现：5、一种用于鲤科鱼类卵巢组织超低温冷冻保存的冷冻液，其特征在于：所述冷冻液包括冷冻液i和冷冻液ii，所述冷冻液i和冷冻液ii均是由二甲基亚砜、胎牛血清、蔗糖、牛血清白蛋白、nacl、kcl、na2hpo4•12h2o 和kh2po4混合，加入双蒸水而成。6、进一步，所述冷冻液i是按照二甲基亚砜10ml，胎牛血清3~8ml，蔗糖2~4g，牛血清白蛋白2~4g，nacl 0.7~1.0g，kcl 0.01~0.03g，na2hpo4•12h2o 0.15~0.16g，kh2po40.01~0.03g混合，加入82~87ml双蒸水而成。7、进一步，所述冷冻液ii是按照二甲基亚砜10ml，胎牛血清3~8ml，蔗糖5~7g，牛血清白蛋白5~7g，nacl 0.7~1.0g，kcl 0.01~0.03g，na2hpo4•12h2o 0.15~0.16g，kh2po40.01~0.03g混合，加入82~87ml双蒸水而成。8、进一步优选地，所述冷冻液i是按照二甲基亚砜10ml，胎牛血清5ml，蔗糖3g，牛血清白蛋白3g，nacl 0.8g，kcl 0.02g，na2hpo4•12h2o 0.154g，kh2po40.02g混合，加入85ml双蒸水而成。9、进一步优选地，所述冷冻液ii是按照二甲基亚砜10ml，胎牛血清5ml，蔗糖6g，牛血清白蛋白6g，nacl 0.8g，kcl 0.02g，na2hpo4•12h2o 0.154g，kh2po40.02g混合，加入85ml双蒸水而成。10、一种用于鲤科鱼类卵巢超低温冷冻保存后复苏的解冻液，其特征在于：所述解冻液包括解冻液i和解冻液ii，所述解冻液i是将dmem、hepes 、胎牛血清和二甲基亚砜混合，再加入双蒸水而成；所述解冻液ⅱ是dmem 、hepes和胎牛血清混合，再加入双蒸水而成。11、进一步，所述解冻液i是按照dmem 1.2~ 1.4g，hepes 0.45~0.5g，胎牛血清4~6ml，二甲基亚砜4~6ml混合，加入88~92ml双蒸水而成。12、进一步，所述解冻液ⅱ是按照dmem 1.2~ 1.4g，hepes 0.45~0.5g，胎牛血清4~6ml混合，加入94~96ml双蒸水而成。13、进一步优选地，所述解冻液i是按照dmem 1.34 g，hepes 0.47g，胎牛血清5ml，二甲基亚砜5ml混合，加入90ml双蒸水而成。所述解冻液ⅱ是按照dmem 1.34 g，hepes 0.47g，胎牛血清5ml混合，加入95ml双蒸水而成。14、一种鲤科鱼类卵巢保存及复苏方法，包括冷冻保存和解冻复苏，其特征在于：所述冷冻保存包括离体卵巢组织预处理成组织碎片，采用冷冻液对组织碎片进行渗透平衡处理，然后进行冷冻，所述冷冻液包括冷冻液i和冷冻液ii，冷冻液i是按照二甲基亚砜10ml，胎牛血清5ml，蔗糖2~5g，牛血清白蛋白2~5g，nacl 0.8g，kcl 0.02g，na2hpo4•12h2o0.154g，kh2po40.02g混合，加入85ml双蒸水而成，冷冻液ii是按照二甲基亚砜10ml，胎牛血清5ml，蔗糖5~7g，牛血清白蛋白5~7g，nacl 0.8g，kcl 0.02g，na2hpo4•12h2o 0.154g，kh2po40.02g混合，加入85ml双蒸水而成。15、进一步，所述解冻复苏包括配制解冻液、冻存卵巢解冻和解冻后培养，所述解冻液分为解冻液i和解冻液ii，解冻液i是按照dmem 1.34 g，hepes 0.47g，胎牛血清5ml，二甲基亚砜5ml混合，加入90ml双蒸水而成，解冻液ⅱ是按照dmem 1.34 g，hepes 0.47g，胎牛血清5ml混合，加入95ml双蒸水而成。16、进一步，所述冻存卵巢解冻是在冻存管于37℃水浴解冻约80~100s，吸出一半冷冻液后加入解冻液i，孵育10 min，再吸出一半上清液，替换为相同体积的冷冻液ii，再孵育10min，最后浸泡在基础培养基（dmem 1.34 g，hepes 0.47g加入100ml双蒸水中）中10min。17、进一步，所述解冻后培养是将解冻的卵巢用pbs洗涤后，用磷酸缓冲液清洗一遍，然后用0.06%的胰蛋白酶消解40 min，终止消解后将残余组织及细胞转移至培养液中，置于28℃的恒温培养箱内培养，得到解冻后培养的卵巢细胞。18、一种鲤科鱼类卵巢冷冻保存方法，其特征在于，包括如下步骤：19、（1）配制冷冻液：冷冻液包括冷冻液i和冷冻液ii，冷冻液i是按照二甲基亚砜10ml，胎牛血清5ml，蔗糖2~5g，牛血清白蛋白2~5g，nacl 0.8g，kcl 0.02g，na2hpo4•12h2o0.154g，kh2po40.02g混合，加入85ml双蒸水而成，冷冻液ii是按照二甲基亚砜10ml，胎牛血清5ml，蔗糖6~7g，牛血清白蛋白6~7g，nacl 0.8g，kcl 0.02g，na2hpo4•12h2o 0.154g，kh2po40.02g混合，加入85ml双蒸水而成；20、（2）离体卵巢预处理：将卵巢组织置于洁净pbs中，去除结缔组织及血管，并剪切成组织碎片；21、（3）卵巢组织碎片渗透平衡：将组织碎片转移到盛有700μl预冷的冻存液ⅰ的冻存管内，置于冰上平衡30min，吸去350μl冻存液ⅰ，加入350μl预冷的冻存保护液ⅱ，置于冰上再平衡5min；22、（4）卵巢组织碎片冻存：将渗透平衡后的组织碎片连同含冻存液ⅱ的冻存管转移至程序降温盒，于-80℃冰箱降温12h，然后转移入液氮保存，得冻存卵巢；23、一种鲤科鱼类卵巢的解冻复苏方法，其特征在于，包括如下步骤：24、（1）配制解冻液：解冻液包括解冻液i和解冻液ii，解冻液i是按照dmem 1.34 g，hepes 0.47g，胎牛血清5ml，二甲基亚砜5ml混合，加入90ml双蒸水而成，解冻液ⅱ是按照dmem 1.34 g，hepes 0.47g，胎牛血清5ml混合，加入95ml双蒸水而成；25、（2）冻存卵巢解冻：冻存管于37℃水浴解冻约80~100s，吸出一半冷冻液，加入等体积解冻液i，孵育10 min，再吸出一半上清液，替换为相同体积的解冻液ii，再孵育10 min，最后浸泡在基础培养基（dmem 1.34 g，hepes 0.47g加入100ml双蒸水中）中10min；26、（3）解冻卵巢的后培养：将解冻的卵巢用pbs洗涤后，用磷酸缓冲液清洗一遍，然后用0.06%的胰蛋白酶消解40 min，终止消解后将残余组织及细胞转移至培养液中，置于28℃的恒温培养箱内培养，得到解冻后培养的卵巢细胞。27、本发明具有如下技术效果：28、本发明提供了一种对于鲤科鱼类卵巢组织的冷冻液，以及冷冻保存及复苏方法，其中通过采用不同浓度的冷冻液i和冷冻液ii对鲤科鱼类的卵巢组织进行两步冷冻保存处理，解冻复苏后的卵巢组织细胞活力更高，且具有优异的体外增殖能力，且加快了冷冻后的卵巢组织在解冻复苏时的解冻速率，减少了解冻期间对细胞的损伤。为鲤科鱼类卵巢的长期保存和物种恢复提供了更高效的途径。