一种大叶桉组织培养方法

本发明属于植物组织培养，具体涉及一种大叶桉组织培养方法。背景技术：1、大叶桉(eucalyptusrobustasmith)桃金娘科、桉属植物，原产于澳大利亚近海肥沃、略带盐分的地方，别称为蚊仔树。大叶桉可高达20米，树皮为稍松软、有不规则的斜裂沟；叶片卵形、厚革质，叶两面均有腺点，有柄；花期9月-10月，花序为伞形；大叶桉果实成熟时果皮呈现深色，有斑点、斑块。大叶桉生长迅速、更新能力强，耐寒性和耐旱性较差，生长周期短，大叶桉在生长过程中生长轮易受到生长环境的影响，但结构均匀，坚硬，心材耐腐。在中药学中，大叶桉味辛、苦，性凉，具有疏风发表，清热解毒，杀虫止痒等功效，常应用于消除细菌、缓解炎症和抗虫等方面。因大叶桉的枝条扦插生根的能力低、种子的繁殖能力弱等因素的影响，使得大叶桉实现工程化繁殖的需求增加。目前,关于大叶桉的国内外研究中，还没有发现关于大叶桉植物组织培养的研究，为此展开本文研究不仅可以为研究大叶桉植物组织培养技术提供理论参考，而且也能推进大叶桉实现快速繁殖工程化的研究进展。研究大叶桉可使大叶桉的药用价值、经济价值得到最大化利用，造福人类。技术实现思路1、本发明的目的是提供一种大叶桉组织培养方法，不仅在短时间内实现大叶桉快速繁殖，还可使大叶桉实现工程化繁殖成为可能。既为研究大叶桉植物组织培养技术提供理论参考，而且也能推进大叶桉实现快速繁殖工程化的研究进展。2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：3、大叶桉组织培养方法，包括步骤如下：4、(1)外植体的处理：以大叶桉种子作为外植体，先后经冷藏暗处理、热处理和消毒；5、(2)种子萌发：将经过处理后的大叶桉种子接种于ms基本培养基中，黑暗条件下培养至种植萌发；6、(3)丛生芽诱导：待种子萌发高至4-5厘米的组培苗，取带1-2个腋芽的茎部，置于丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导；7、(4)壮苗培养：待丛生芽生长高2-3厘米，取出丛生芽接入含有6-ba和naa的壮苗培养基中进行壮苗培养；8、(5)生根培养：待组培苗长高至4-5cm，将其移入含有生根植物激素和核黄素的生根培养基中，进行生根培养。9、步骤(1)中，选用成熟度高、无杂质、饱满的大叶桉种子作为外植体。黑暗处理条件为将大叶桉种子放入-20℃-3℃中暗处理24-48h。热处理条件为：大叶桉种子浸没于水中，45℃恒温水浴6-8h。消毒处理中，使用75％酒精浸泡大叶桉种子30s，无菌水震荡、冲洗3次，而后用0.1％升汞浸泡消毒2-8min，再用无菌水震荡、冲洗5次。10、优选地，步骤(1)外植体处理：将种子置于-18℃中储藏48h后取出，放入45℃的恒温水浴锅中恒温泡8h，大叶桉种子萌发数量增加。11、步骤(2)中，ms基本培养基采用改良ms基本培养基，优选包含改良ms+1mg/l ga3+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为5.8±0.2，种子萌发数量最多，品质最好。12、优选地，外植体消毒：75％酒精30s后0.1％升汞溶液消毒4min，种子污染率适中，种子萌发数量最高。13、步骤(3)中，丛生芽诱导的培养的温度控制在25±2℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为12h/d。丛生芽诱导培养基包含改良ms+3.2mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为5.8±0.2，平均每瓶丛生芽个数为3棵。14、步骤(4)中，因大叶桉组培苗生长良好，会产生单宁物质，使壮苗过程中发生褐化导致组培苗死亡，为防止这种状况发生，需在壮苗培养基中加入适量的核黄素。壮苗培养条件：每瓶培养基中接入3棵丛生芽，培养的温度控制在25±2℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为12h/d。15、步骤(4)中的壮苗培养基为：改良ms+4mg/l 6-ba+2mg/l iba+0.8mg/l核黄素+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、改良ms+2mg/l 6-ba+2mg/l iba+4mg/l核黄素+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、或改良ms+4mg/l 6-ba+0.8mg/l iba+4mg/l核黄素+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为5.8(±0.2)，组培苗生长良好，后两个培养基生根。16、步骤(5)中，在壮苗过程中，会生长出少许根，用灭菌后的手术剪将根部剪掉后移入生根培养基中，诱导组培苗长出根系。生根培养条件：每瓶培养基接入2-3株苗，培养的温度控制在25±2℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为12h/d。17、步骤(5)的生根培养基为：改良ms+2.4mg/l iba+4mg/l核黄素+30g/l蔗糖+7g/l琼脂、改良ms+3.2mg/l iba+4mg/l核黄素+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为5.8(±0.2)，生根率高达100％，组培苗生长良好。18、本发明的有益效果是：19、1.本发明提供的大叶桉组织培养方法中，前期对大叶桉种子进行低温处理暗处理，然后将种子置于恒温水浴中进行浸种处理。低温处理可以实现大叶桉种子统一进入休眠，恒温浸种可以使种子复苏，可以有效加快种子的发芽时间和发芽数，提高种子的发芽率。20、2.本发明使用75％酒精30s+0.1％升汞液4min的消毒方法，种子的污染率适中，种子萌发数量最多。21、3.本发明中，诱导种子萌发的培养基最佳激素配比为：改良ms基本培养基+1mg/lga3，在此激素配比下，种子的萌发数量最高。诱导大叶桉产生丛生芽的丛生芽诱导培养基最佳激素配比为：改良ms基本培养基+3.2mg/l6-ba+0.8mg/l naa，丛生芽个数多，为3棵，丛生芽茎和叶生长快且茎粗壮，叶绿。22、4.本发明中，大叶桉组培苗的壮苗培养基激素配比为：改良ms+4mg/l6-ba+2mg/liba+0.8mg/l核黄素、改良ms+2mg/l6-ba+2mg/liba+4mg/l核黄素以及改良ms+4mg/l 6-ba+0.8mg/l iba+4mg/l核黄素，在这些培养基中，组培苗生长良好，在后两个培养基中，出现生根现象，有利于大叶桉生根培养的进行。大叶桉组培苗生根的培养基激素配比为：改良ms+2.4mg/l iba+4mg/l核黄素、改良ms+3.2mg/l iba+4mg/l核黄素，在这些生根培养基中，生根率高达100％，根毛多，且根系发达。23、4.本发明的步骤(1)至(5)的培养条件均为：温度控制在(25±2)℃；光照强度为1500～2000lx；光照时间为12h/d。适宜的温度、光照强度和光照时间可以促进大叶桉种子萌发后的生长、丛生芽诱导、壮苗验、生根的进行，为大叶桉组培苗创造良好的环境。技术特征：1.大叶桉组织培养方法，其特征是，包括步骤如下：2.根据权利要求1所述的大叶桉组织培养方法，其特征是，所述步骤(2)中，ms基本培养基采用改良ms基本培养基，包含改良ms+1mg/l ga3+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为6。3.根据权利要求1所述的大叶桉组织培养方法，其特征是，所述步骤(3)中，丛生芽诱导培养基包含改良ms+3.2mg/l 6-ba+0.8mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为5.6，平均每瓶丛生芽个数为3棵。4.根据权利要求1所述的大叶桉组织培养方法，其特征是，所述步骤(4)中的壮苗培养基为：改良ms+2mg/l 6-ba+2mg/liba+4mg/l核黄素+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为5.6。5.根据权利要求1所述的大叶桉组织培养方法，其特征是，所述步骤(4)中，壮苗培养条件：每瓶培养基中接入3棵丛生芽，培养的温度控制在23℃，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d。6.根据权利要求1所述的大叶桉组织培养方法，其特征是，所述步骤(5)的生根培养基为：改良ms+2.4mg/l iba+4mg/l核黄素+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph值为6。7.根据权利要求1所述的大叶桉组织培养方法，其特征是，所述步骤(5)中，生根培养条件：每瓶培养基接入2-3株苗，培养的温度控制在27℃，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d。技术总结本发明公开了一种大叶桉组织培养方法，包括步骤如下：以大叶桉种子作为外植体，先后经冷藏暗处理、热处理和消毒；将经过处理后的大叶桉种子接种于MS基本培养基中，黑暗条件下培养至种植萌发；待种子萌发高至4‑5厘米的组培苗，取带1‑2个腋芽的茎部，置于丛生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导；待丛生芽生长高2‑3厘米，取出丛生芽接入含有6‑BA和NAA的培养基中进行壮苗培养；待组培苗长高至4‑5cm，将其移入含有生根植物激素和核黄素的生根培养基中，进行生根培养。本发明不仅大叶桉在短时间内实现快速繁殖，可使大叶桉实现工程化繁殖成为可能。技术研发人员：卢海啸,黄淑妹,韦金秋,梁艳金受保护的技术使用者：玉林师范学院技术研发日：技术公布日：2024/5/16