一种茶树组培苗高效继代增殖方法

本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种茶树组培苗高效继代增殖方法。背景技术：1、茶树(camellia sinensis l)属于山茶科山茶属灌木或小乔木，为多年生常绿木本植物(蒋宇航等，2017)，在中国、印度、越南、日本、斯里兰卡等国家广泛种植。近年来，随着茶树种植规模迅速扩大，优质健康原种茶苗的需求量急剧增大，茶树工厂化育苗生产越来越受到重视。目前茶树的繁殖方式以有性繁殖和扦插繁殖为主，然而茶树实生繁殖存在自然萌发率低、需种量大、解除休眠操作繁琐、播种育苗发芽率低等问题，而扦插繁育的无性系茶苗病毒累积、抗病虫害能力较为薄弱，无主根、侧根系较发达，不耐旱，在干旱环境下成活率低，且繁殖材料消耗多，插穗不易贮存，这些都是限制茶树规模化种植的主要因素，严重影响茶叶产量、质量及效益。目前，茶树无性种苗已经成为制约茶产业提质发展的瓶颈。2、较传统无性繁殖方法而言，植物离体再生技术具有培养周期短、增殖率高、种苗生产不受时间与地域限制、培养条件人为可控、省时省力、成本低等优点,在茶树优质种苗规模化繁育、种质资源保存以及优良品种快速推广应用等方面具有重要意义。已报道的茶树离体再生研究主要经由器官发生途径获得不定芽或再生植株,体细胞胚胎发生研究少见,且进展较为缓慢。陈泽雄等(2009)以渝茶1号茶树腋芽作为外植体进行茶树离体再生研究,不定芽诱导率达71.1％,增殖系数为3.37,生根率达55.6％。刘静等(2020)进行了茶树腋芽诱导培养,诱导率为92％,但未见丛芽,仅有单个定芽。茶树茎段为起始外植体诱导出芽的报道比较多见,但效率不高,繁殖系数在3左右(陈泽雄等,2009)。任露露等(2023)以‘舒茶早’无菌苗茎段为起始外植体开展茶树茎段不定芽发生体系研究,不定芽诱导率达88.89％,繁殖系数为7.88,虽然提高了茶树茎段不定芽的诱导率和繁殖系数，但该方案不能控制芽苗的玻璃化、褐化问题，也不能解决组培苗在连续数代的扩繁培养中分化再生能力丧失的问题，从而无法获得在培养许多代之后仍然保持着旺盛的增殖能力的不定芽。3、由于茶树是多年生植物、多酚类物质含量高等本身特性引起，易造成愈伤组织易褐化、难以分化、基因不能按序表达，使最初所表现的植株再生能力随着继代培养次数和时间的增加逐渐下降，甚至完全消失。现有的关于茶树的不定芽诱导和继代增殖的培养配方均采用ms培养基，而ms培养基的高无机盐和高氮浓度极易导致幼芽基部愈伤组织褐化，经过数轮继代培养后不定芽生长缓慢，芽苗老化，造成增殖继代培养时的分生能力及生长势逐步减弱。目前，茶树组培苗经过同一种培养基和激素配方的多次继代培养之后退化严重，关于适合茶树不定芽长期继代增殖的研究尚未见报道。技术实现思路1、为了克服茶树组培技术的关键环节一继代增殖，提高茶树愈伤组织的抗褐化能力提高组培苗在连续继代培养中的增殖效果，在较短时间内获得继代增殖系数高、活力旺盛、不易老化的不定芽材料；本发明提供了一种茶树组培苗高效继代增殖方法。具体通过以下方式实现：2、一种茶树组培苗高效继代增殖方法，包括以下步骤：3、1)选取无病虫害的茶树实生苗，自顶端向下剪取带芽嫩茎作为茶树外植体；4、2)对茶树外植体进行杀菌消毒处理；5、3)将杀菌消毒后的茶树外植体按照生物学下端接种到不定芽诱导培养基中培养25-30d；6、4)切取培养后茶树外植体的不定芽，将切取到的不定芽转接至增殖培养基中进行继代增殖培养，培养30-35d，形成丛生芽；7、5)将丛生芽切成多个芽块，每个芽块有3-4个小芽，将芽块转接到无外源激素添加培养基上培养；培养一段时间后芽块分化出小植株；小植株退激素的同时基部又分化出大量的从生芽，并随培养时间的延长而伸长；8、6)将步骤5)中的丛生芽块分割成单芽后转接到增殖培养基进行继代培养；9、7)重复上述步骤4)—6)，直到达到需要的育苗数量。10、作为本发明的优选方案，所述步骤1)中，茶树外植体的选取具体为：选取1年生无病虫害的茶树实生苗，自顶端向下剪取长度为2-4cm的带芽嫩茎，保留1-2个腋芽点；将茎段上方的切口剪成水平的，茎段下方的切口剪成斜向的，并剪除茎段底部的下部叶片,留下茎段顶端的一两片叶子并切除远端,保留靠叶柄部位的1/4。11、作为本发明的优选方案，所述步骤2)中，对茶树外植体进行杀菌消毒处理具体为：将茶树外植体置于超净工作台，第一次先用酒精浸泡处理30-40秒，升汞浸泡并搅拌6-8分钟，用无菌水冲洗3-5次；第二次再用0.1％升汞消毒6-8分钟，用无菌水冲洗3-5次。12、作为本发明的优选方案，步骤3)中所述不定芽诱导培养基的配方为：在基础培养基中添加1-1.5g/l的花多多1号+0.5-1mg/l的zt+0.5-1mg/l的iaa+20-30mg/l的柠檬酸+25-30g/l的蔗糖+4.5-5.5g/l的琼脂粉，并调节ph至5.7-6.0。13、作为本发明的优选方案，步骤4)中所述增殖培养基的配方为：在基础培养基中添加1-1.5g/l的花多多1号、0.5-1mg/l的zt、2-4mg/l的2ip(2-异戊烯基腺嘌呤)、2-4mg/l的amp(一磷酸腺苷)、0.1-0.5mg/l的iba、6-10mg/l的尿囊素、25-30g/l的蔗糖+4.5-5.5g/l的琼脂粉，并调节ph至5.7-6.0。14、作为本发明的优选方案，所述基础培养基的配方为：79.43mg/l的kno3、372.2mg/l的kh2po4、795.91mg/l的kcl、227.97mg/l的nh4h2po4、471.2mg/l的ca(no3)2·4h2o、185mg/l的mgso4·7h2o、3.1mg/l的h3bo3、11.15mg/l的mnso4·4h2o、4.3mg/l的znso4·4h2o、0.415mg/l的ki、0.125mg/l的na2moo4·2h2o、0.0125mg/l的cuso4·5h2o、0.0125mg/l的cocl2·6h2o、13.9mg/l的feso4·7h2o、18.7mg/l的na2-etda、50mg/的肌醇l、0.25mg/l的烟酸、0.5mg/l的维生素b1、0.5mg/l的维生素b6；基础培养基中氮磷钾养分质量比为7：6：19。15、作为本发明的优选方案，步骤5)中所述无外源激素添加培养基的配方为：在1/2ms培养基中添加20-30mg/l的柠檬酸、1-1.5g/l的蛋白胨、15-18g/l的鲜榨苹果汁、25-30g/l的蔗糖、4.5-5.5g/l的琼脂粉，并调节ph至5.7-6.0。16、作为本发明的优选方案，在不定芽诱导培养基、增殖培养基和无外源激素添加培养基中的培养条件均为24～28℃，1500～2500lux，每天光照12～14h。17、与现有技术相比，本发明所具有的有益效果有：18、1)本发明使用低氮低磷高钾比例培养基使茶树组织培养的褐化率降低到10％以下，使不定芽诱导率达到90％以上,有效地促进了茶树不定芽的分化和发育,解决了茶树愈伤组织褐化、不定芽诱导率低和植株长势弱等问题；19、2)本发明在不定芽继代增殖培养基中添加2ip激素可促进愈伤组织分化，诱导生芽，延缓植物衰老，相比添加高浓度的6-ba(6-苄氨基嘌呤)和tdz(噻苯隆)可有效地减轻试管苗玻璃化，同时添加amp和尿囊素这两种代谢物，能够极大提高非多能性愈伤的芽再生效率，大幅度提高组培苗的增殖倍数。20、3)本发明通过继代过程中增殖培养基和无外源激素添加培养基的交替使用，使增殖与壮苗合为一步，实现不定芽快速增殖生长，使组培苗在继代培养过程中增殖率和增殖系数始终提高到90％和7-10倍，从而获得继代增殖系数高、生长活力旺盛、不易老化的继代芽。