积雪草离体保存方法与流程

本发明涉及植物组培。更具体地说，本发明涉及一种积雪草离体保存方法。背景技术：1、积雪草centella asiatica(l.)urban.为伞形科积雪草属草本植物，其干燥全草入药，据记载：积雪草味苦、辛，性寒，具有清热利湿，解毒消肿等功效，用于湿热黄疸，痈肿疮毒等症，为我国传统常用中药材。积雪草在医药、保健食品和美容等领域已得到广泛的应用和，吸引了众多企业生产，市场前景广阔，也成为研究者关注的热点。引种栽培、人工繁育等成为有效利用积雪草资源的新途径，但是现有技术在保存组培苗时，离体保存时间短，亟需提供一种能够延长积雪草离体保存时间的组培方法。技术实现思路1、本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。2、本发明还有一个目的是提供一种积雪草离体保存方法，其通过改变培养条件及培养基成分，可有效延长积雪草离体保存时间。3、为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种积雪草离体保存方法，包括以下步骤：4、获取积雪草瓶苗，并将积雪草瓶苗接种至第三培养基中进行离体保存培养，其中，第三培养基包括1/2ms、0.03mg/l 6-苄氨基嘌呤、0.6-1.4mg/l青鲜素、0.2-0.8mg/l多效唑、0.2-0.8g/l活性炭。5、优选的是，获取积雪草瓶苗的方法为：获取积雪草无菌外植体，并将积雪草无菌外植体接种至第一培养基进行诱导培养，得到诱导芽，再将诱导芽接种至第二培养基进行壮苗培养，得到积雪草瓶苗。6、优选的是，第一培养基包括ms、0.2-0.8mg/l 6-苄氨基嘌呤、0.1-0.3mg/l萘乙酸，其中，培养温度为22-26℃，光照强度为1200-1800lx，每天光照时长为10-14h，培养时间为21d。7、优选的是，第二培养基包括ms、0.1-0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤、0.02-0.08mg/l萘乙酸、0.5-1.5g/l活性炭，其中，培养温度为22-26℃，光照强度为1200-1800lx，每天光照时长为10-14h。8、优选的是，将积雪草瓶苗移栽至第三培养基之前，先使用无菌浸泡液浸泡瓶苗根部8h，其中，无菌浸泡液的制备方法为：取熟地花花瓣粉碎，得到粉碎料，向粉碎料中加入粉碎料20倍量的水并回流6-7h，过滤，得到滤液；向滤液中加入滤液总质量0.2倍量的芦荟、滤液总质量0.2倍量的梧桐花、滤液总质量0.7倍量的橄榄叶，置于22-23℃条件下非封闭发酵48h，然后向体系中加入滤液总质量0.1倍量的枯草芽孢杆菌液、滤液总质量0.2倍量的红茶菌菌液封闭发酵5d，最后再非封闭发酵2d，即得到浸泡液，使用0.22μm的微孔滤膜对浸泡液过滤灭菌得到无菌浸泡液。9、优选的是，在使用无菌浸泡液浸泡瓶苗之前，取部分无菌浸泡液进行浓缩，得到浓缩液，并使用0.22μm的微孔滤膜对浓缩液过滤灭菌，将浓缩液加入第三培养基中，第三培养基中浓缩液的浓度为1mg/l。10、优选的是，在离体培养基中培养的条件包括：在离体培养基中培养的第一个月，每天白天的培养温度为20-22℃，光照强度为1000lx，夜间培养温度为10-11℃；从第二个月起培养两个月，每天白天的培养温度为18-20℃，光照强度为1200lx，夜间培养温度为12-14℃，从第四个月起培养三个月，每天白天的培养温度为18-20℃，光照强度为1800lx，夜间培养温度为15-17℃；从第七个月起，每天白天的培养温度为22-23℃，光照强度为1500lx，夜间培养温度为17-19℃。11、本发明至少包括以下有益效果：12、本发明通过在第三培养基中添加青鲜素及多效唑进行保存积雪草瓶苗，可使积雪草瓶苗的离体保存时间延长至281天；本发明使用含有芦荟、橄榄叶、梧桐花浸泡液进行浸泡以及将浓缩液添加至第三培养基中，可有效延长积雪草离体保存时间，且芦荟、橄榄叶、梧桐花协同作用才可明显改变离体保存时间；本发明通过改变白天和夜间之间的温度差及对应的改变光照强度，可有效延长积雪草离体保存时间；本申请通过使用含有芦荟、橄榄叶、梧桐花的浸泡液进行浸泡以及将浓缩液加入第三培养基中，可有效提高移栽成活率。13、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。技术特征：1.积雪草离体保存方法，其特征在于，包括以下步骤：2.如权利要求1所述的积雪草离体保存方法，其特征在于，获取积雪草瓶苗的方法为：获取积雪草无菌外植体，并将积雪草无菌外植体接种至第一培养基进行诱导培养，得到诱导芽，再将诱导芽接种至第二培养基进行壮苗培养，得到积雪草瓶苗。3.如权利要求2所述的积雪草离体保存方法，其特征在于，第一培养基包括ms、0.2-0.8mg/l 6-苄氨基嘌呤、0.1-0.3mg/l萘乙酸，其中，培养温度为22-26℃，光照强度为1200-1800lx，每天光照时长为10-14h，培养时间为21d。4.如权利要求2所述的积雪草离体保存方法，其特征在于，第二培养基包括ms、0.1-0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤、0.02-0.08mg/l萘乙酸、0.5-1.5g/l活性炭，其中，培养温度为22-26℃，光照强度为1200-1800lx，每天光照时长为10-14h。5.如权利要求1所述的积雪草离体保存方法，其特征在于，将积雪草瓶苗移栽至第三培养基之前，先使用无菌浸泡液浸泡瓶苗根部8h，其中，无菌浸泡液的制备方法为：取熟地花花瓣粉碎，得到粉碎料，向粉碎料中加入粉碎料20倍量的水并回流6-7h，过滤，得到滤液；向滤液中加入滤液总质量0.2倍量的芦荟、滤液总质量0.2倍量的梧桐花、滤液总质量0.7倍量的橄榄叶，置于22-23℃条件下非封闭发酵48h，然后向体系中加入滤液总质量0.1倍量的枯草芽孢杆菌液、滤液总质量0.2倍量的红茶菌菌液封闭发酵5d，最后再非封闭发酵2d，即得到浸泡液，使用0.22μm的微孔滤膜对浸泡液过滤灭菌得到无菌浸泡液。6.如权利要求5所述的积雪草离体保存方法，其特征在于，在使用无菌浸泡液浸泡积雪草瓶苗之前，取部分无菌浸泡液进行浓缩，得到浓缩液，并使用0.22μm的微孔滤膜对浓缩液过滤灭菌，将浓缩液加入第三培养基中，第三培养基中浓缩液的浓度为1mg/l。7.如权利要求1所述的积雪草离体保存方法，其特征在于，在离体培养基中培养的条件包括：在离体培养基中培养的第一个月，每天白天的培养温度为20-22℃，光照强度为1000lx，夜间培养温度为10-11℃；从第二个月起培养两个月，每天白天的培养温度为18-20℃，光照强度为1200lx，夜间培养温度为12-14℃，从第四个月起培养三个月，每天白天的培养温度为18-20℃，光照强度为1800lx，夜间培养温度为15-17℃；技术总结本发明公开了一种积雪草离体保存方法，包括以下步骤：获取积雪草瓶苗，并将积雪草瓶苗接种至第三培养基中进行离体保存培养，其中，第三培养基包括1/2MS、0.01‑0.03mg/L 6‑苄氨基嘌呤、0.6‑1.4mg/L青鲜素、0.2‑0.8mg/L多效唑、0.2‑0.8g/L活性炭。获取积雪草瓶苗的方法为：获取积雪草无菌外植体，并将积雪草无菌外植体接种至第一培养基进行诱导培养，得到诱导芽，再将诱导芽接种至第二培养基进行壮苗培养，得到积雪草瓶苗。本发明通过改变培养条件及培养基成分，可有效延长积雪草离体保存时间。技术研发人员：张占江,张坤,覃雅,李林轩,李倩,丘卓秋,韦树根,李翠,雷明,潘丽梅,谭桂玉,万凌云,韦莹,霍娟受保护的技术使用者：广西壮族自治区药用植物园技术研发日：技术公布日：2024/5/12