一种诱导玉蜀黍属植物茎生根尖的方法及其在染

本发明属于细胞遗传学领域，具体涉及一种诱导玉蜀黍属植物茎生根尖的方法；还涉及该方法在玉蜀黍植物染色体制片上的用途。背景技术：1、玉米(zea mays l.)是重要的粮食作物、饲料作物和工业原料，随着全球人口增加和人们生活水平的提高，对玉米的需求也显著增加，现有的玉米产量早已远远不能满足需要，而提高玉米单产是提高玉米总产量的重要途径，培育高产、优质的新品种又是提高玉米单产的主要手段。2、在长期的自然选择和进化过程中，玉米近缘种属形成了极为丰富的变异类型，如抗逆性、抗病性、抗虫性、高蛋白、高淀粉或高油等特性，为玉米育种提供了丰富的种质基础。但是由于生殖隔离的存在，通过远缘杂交手段直接将这些优良性状转移到玉米中存在不能结实、染色体丢失、染色体易位等各种问题。而要解决这些问题，需要对玉米与这些近缘种属的远缘杂交后代进行细胞遗传学研究，而细胞遗传学研究的基础首先是进行染色体制片。3、目前，用于玉米染色体制片的材料主要是种子萌发根，这对于有足够种子数量的玉米纯系或遗传背景一致的单交种是可行的；但是，当需要鉴定玉米与其近缘种属远缘杂交所产生的种子的染色体数量和组成时，每一粒种子的染色体数目和组成均有可能不同(iqbal等.planta.2019，249，1949-1962)，需要单独进行鉴定。而单个种子发芽后的根尖数量有限，且切取根尖后常常仍需将该材料种植用于后期性状观测、育种或其他研究，将植株种植于田间，挖掘取根后植株较多的根尖和根毛受损，造成水分吸收功能急剧下降，植株受损严重，严重影响其后期的生长发育和结实。专利“一种多次获取大量植物根尖的盆栽装置”(专利号：cn201720040618.x)公开了一种利用花盆和塑料薄膜组成的获取根尖的装置，可重复获取植物幼嫩根尖，但是此种方法仍然没有改变取根后会影响植株后期的正常生长发育和结实，并且当遇到大批量植株染色体需要鉴定时，还存在花盆、营养土等材料费较高，频繁浇水、植株管护繁琐、取根劳动强度大等问题。因此，亟待寻找一种更为简易的方法，在大批量获取根尖分生组织完成染色体制片的同时，不破坏植株地下根系生长，最大程度地使植株完成正常的生长发育以利于后续该植株的性状观测、育种或其他研究。技术实现思路1、针对目前用种子萌发根尖进行染色体制片时影响植株的正常生长发育、以及盆栽方法取根时劳动强度大、成本高等问题，本发明目的在于提供一种诱导玉蜀黍属植物茎生根尖的方法。2、本发明另一目的在于提供上述方法在玉蜀黍属植物染色体制片上的应用。3、本发明通过以下技术方案实现：4、本发明一种诱导玉蜀黍属植物茎生根尖的方法，包括如下步骤：5、(1)茎节选择：在待鉴定玉蜀黍属植物的抽雄-散粉期，若茎节生有新生气生根，则剪掉气生根的根冠区；若茎节尚未出现气生根，则剔除近地面茎节上的叶片，使茎节露出；6、(2)茎生根尖诱导：①在茎秆基部和待高压繁殖茎节的上方10～15cm处涂抹薄荷油；②用高压繁殖盒包裹步骤(1)已剪去根冠的气生根处或暴露的茎节处，③用基质填满高压繁殖盒并用线绳缠绕固定，④用黑色塑料薄膜包裹高压繁殖盒,⑤最外层用铝箔纸包裹高压繁殖盒；⑥高压繁殖进行4～10天；7、(3)根尖获取：在晴天上午的9:00～11:00，依次打开铝箔纸和黑色塑料薄膜，查看不定根生长情况；若见不定根生成，打开高压繁殖盒，敲击植株茎秆抖落茎节上的基质或用镊子轻轻剥离基质直至幼嫩根尖暴露，立即用镊子于距离幼嫩根尖端1～2cm处夹取根尖，将该幼嫩根尖洗净后立即装入带有双蒸馏的ep管中，即获得了玉蜀黍属植物的茎生根尖。8、上述方法步骤(3)中，若仍需收集根尖，则按步骤(2)所述方法重新安装高压繁殖盒，每隔3～5天夹取根尖，直至取够根尖或茎节不再长根。9、上述方法步骤(1)中所述的玉蜀黍属植物指玉蜀黍属(zea)内的玉米(zea mays)或墨西哥大刍草(zea mexicana)等、属内的种间杂交种、以及玉蜀黍属和摩擦禾属(tripsacuml.)之间的属间杂交种；还包含了玉蜀黍属内或属间杂交产生的单倍体、二倍体、多倍体和非整倍体材料。10、上述方法步骤(1)中所述的新生气生根是指未完全角质化的幼嫩气生根，其长度小于3cm。11、上述方法步骤(1)中所述的近地面茎节是指植株地上部靠近地面最近的无气生根茎节。12、上述方法步骤(2)中所述的基质可于市场上购买。如从丹麦进口的品氏泥炭土等；其制备方法为：按照质量比为1.3～1.4：1的比例向干燥无霉变的品氏泥炭土(型号0-6，粒径0-6mm)中加水，混合均匀即可。13、上述方法步骤(2)或(3)中所述的高压繁殖盒的材质为透明塑料。高压繁殖盒可从市场上购买，或用透明的塑料瓶自制，如可用透明的矿泉水瓶自制。以550ml农夫山泉矿泉水瓶为例，其具体制作方法：沿着矿泉水瓶瓶口锥体与瓶体圆柱体交界线剪开，再用枝剪垂直于瓶底剪开瓶体，随后切口连着瓶底剪至瓶底中心处，并将瓶底中心处剪成与待鉴定玉米植株基部直径大小一致的小孔。14、上述方法步骤(3)中所述的根尖是指特征为色白、幼嫩且根冠区直径大于1.0mm的幼嫩根尖。15、上述方法在玉蜀黍属植物染色体制片上的应用。16、上述方法在玉蜀黍属植物染色体鉴定上的应用。17、本发明还提供了茎生根尖在玉蜀黍属植物染色体制片上的应用；其中所述的茎生根尖按照上述方法制备。18、本发明还提供了茎生根尖在玉蜀黍属植物染色体鉴定上的应用；其中所述的茎生根尖按照上述方法制备。19、本发明还提供了利用茎生根尖进行玉蜀黍属植物染色体制片的方法，包括如下步骤：20、(1)根尖预处理：在室温下，将上述方法所得玉蜀黍属植物茎生根尖用饱和α-溴萘预处理3h；21、(2)固定：在4℃下，将经预处理的茎生根尖于3:1乙醇/冰醋酸中固定12～24h；22、(3)保存：将固定后的茎生根尖依次通过95％、80％和70％乙醇梯度置换，每次置换停留20～30min，将固定液中的乙酸从根尖分生组织中置换掉，然后在-20℃下储存于70％乙醇中；23、(4)酶解：用蒸馏水将储存的茎生根尖洗涤3次，然后用锋利刀片切掉茎生根尖分生组织前端的根冠区和后端的伸长区，再将茎生根尖分生组织放入0.2ml pcr管中；在37℃下，按每个根尖加入混合酶液20μl的比例加入混合酶液，酶解1～3h；24、(5)染色体制片：将酶解后的茎生根尖分生组织通过压片、涂片、滴片或蒸片进行染色体制片；还包括后续通过荧光原位杂交或基因组原位杂交完成的染色体制片；25、(6)镜检是指：在光学显微镜下，先用低倍镜(20×)寻找良好的染色体中期分裂相；然后用高倍油镜(100×)观察染色体；选择染色体分散良好、形态清晰的细胞进行摄像。26、上述方法步骤(4)中所述混合酶液的组成成分及其体积比为：6％(w/v)纤维素酶：1％(w/v)果胶裂解酶＝1：1。27、所述混合酶液的制备方法，按照体积比为1：1的比例将6％(w/v)纤维素酶和1％(w/v)果胶裂解酶混合均匀即可。28、与现有的利用种子根尖和盆栽获取的根尖进行染色体制片相比，本发明具有的优点和有益效果为：(1)本发明方法单次获得的幼嫩根尖数量大，单次可以获得至少6个以上的幼嫩根尖，多则可达100余个幼嫩根尖，可满足大规模染色体制片的需求。而种子发根获取的根尖通常只有极少量根可用(通常1个初生根根尖)，且可能得不到较好的细胞分裂相；(2)本发明方法制作的染色体制片背景清晰、中期染色体分裂相好，形态清晰，可清楚显示染色体的数目和特征，所得染色体的鉴定结果准确、可靠。(3)本发明方法取材后不影响植株的原生根系，不影响植株的正常生长发育，可避免珍贵遗传材料的丢失，对于珍贵的遗传材料和远缘杂交育种后代选择具有重要意义。(4)本发明方法节省了盆栽方法获取根尖所需的材料成本。盆栽取根需要大量的花盆、营养土，且花盆历经较长时间的日晒、雨淋，致使其老化较快。本发明方法只需少量的营养土，且营养土和高压繁殖盒均可重复多次利用。(5)本发明方法大幅度降低了盆栽方法获取根尖所需的劳动力成本。营养土混合、装盆、从幼苗移栽到种子成熟等环节，需频繁地向盆中浇水，取根时需要将盆中整个植株提起、放回，劳动强度大。本发明方法从植株地上部取根，打开高压繁殖盒抖落基质即可完成取根，大大降低了劳动强度。(6)本发明与盆栽取根相比更易获得优质根尖。盆栽植株根系生长于营养土中，只有触及盆周的幼嫩根尖才能被获取，且幼嫩根尖接触盆体，高温下容易被烫伤，隐藏于营养土中的优质根尖无法被获取，或为了获取需抖落营养土暴露根系，这将极大地影响植株生长。(7)本发明与盆栽取根相比获得根尖的时间短。盆栽一般至少30天以上才能获得根尖，而本发明方法约1周即可获取根尖。(8)本发明与盆栽取根相比扩展了植株获取根尖的时间。盆栽取根需要在植株营养生长阶段完成，进入生殖生长植株不再长出幼嫩根尖。本发明方法在植株进入抽雄期仍可进行诱导生根。(9)本发明方法在高压繁殖茎节的上、下部涂抹薄荷油，可防止蚂蚁于高压繁殖盒中筑巢或活动。(10)本发明方法中利用透明塑料制作高压繁殖盒，可随时观察生根情况。(11)本发明用黑色塑料薄膜包裹高压繁殖盒，可避免光线对根尖的影响。(12)本发明采用铝箔纸作为最外层包装，可起到反光隔热的作用，对于高压繁殖盒内的根尖发育有重要作用。