菠菜对霜霉病的持久抗性的制作方法

本发明涉及植物育种和分子生物学领域，更具体地涉及提供对霜霉病的抗性的新基因及其应用。背景技术：1、菠菜(spinacia oleracea)是一种来自苋科的作为蔬菜种植的有花植物。菠菜的可食用部分为营养阶段的叶片。菠菜以散装、捆扎、置于预包装袋中、罐装或冷冻方式出售。菠菜有3种基本类型，即卷叶、半卷叶和平叶类型。卷叶菠菜具有折皱卷曲的叶片。平叶或光叶菠菜具有大体上宽阔、光滑的叶片。半卷叶菠菜是具有轻微卷曲的叶片的品种。菠菜的主要市场是嫩叶。嫩菠菜叶通常是平叶品种，并且收获的叶片通常不长于约8厘米。这些柔软、甘甜的叶片散装出售而不是捆扎出售。它们常用于沙拉中，但还可以轻微烹调。菠菜霜霉病由病原体散展霜霉(peronospora effusa，也称作菠菜粉霜霉p.farinosaf.sp.spinaciae)导致，对菠菜种植者而言霜霉病是主要威胁，因为霜霉病影响收获的植物部分，即叶片。感染使叶片不适合出售和食用，在表型上表现为老叶上的黄色病斑，并且在远轴叶表面上可观察到浅灰色的真菌生长。感染可非常迅速地蔓延，并且可发生在温室栽培中、垂直农业中和土壤栽培中。散展霜霉形成和萌发的最佳温度是9至12℃，并且高相对湿度的促进该过程。当病原体沉积在潮湿的叶片表面上时，可容易地萌发并感染叶片。在8至20℃和≥80％的相对湿度下，病原体生长最佳，并且可在感染后的6至13天之内观察到生长。散展霜霉在土壤中可存活高达3年，或在种子或活体植物中存活。已知对由散展霜霉导致的霜霉病具有至少部分抗性的各种植物或种质，例如来自孟山都蔬菜知识产权管理(spinacia oleracea l.，kona-swb2636以及smbsl51262-smbs015-1262m)，来自shehongbing等2018(fine mapping and candidate gene screening of the downy mildewresistance gene rpfl in spinach)以及wo2013/064436。在本技术领域中已知调控植物生长和表型的方法，例如来自us 2017/037422。此外，已知各种菠菜基因，可从ncbi数据库中获取。近年来已鉴定到为菠菜植株提供针对霜霉病的抗性的各种抗性基因。然而，已观察到现有的抗性菠菜栽培种可能再次变得对病原体易感。研究表明，栽培种自身并未改变，因此霜霉病抗性的丧失必然是由于散展霜霉克服了这些菠菜栽培种的抗性。已在用于测试菠菜栽培种的抗性的分化参考集上鉴定出能够感染抗性菠菜栽培种的霜霉病小种。分化集包含对当前已鉴定的致病小种具有不同的抗性模式的一系列菠菜栽培种(杂交种)。目前，已正式鉴定并描述了19种菠菜霜霉病的致病小种(pe)。在1990至2009年间，鉴定了小种4至10，它们表明病原体克服菠菜的抗性的多样性和适应性。在2014年，阿肯色大学的correll实验室鉴定了分离株ua1014aplp(也称作ua1014，现在是pe：17)。菠菜霜霉属国际工作小组(iwgp)将两个新的菠菜散展霜霉小种命名为pe：18和pe：19。这两个小种为菠菜产业带来重大威胁。2、在不同地理区域，会出现致病小种或分离株的不同组合，因此菠菜产业强烈需要对尽可能多的相关霜霉病小种具有抗性的菠菜栽培种，优选对可能出现在其地区的所有小种，甚至对无法用存在于市售的菠菜栽培种中的抗性对抗的最新的威胁具有抗性。3、重要的是保持在本领域的发展前沿，这是由于霜霉属破坏存在于市售的菠菜栽培种中的抗性的能力持续发展。为此，新的抗性基因是非常有价值的财产，它们在菠菜育种中形成重要的研究重点。由于存在无法找到针对新产生的病原体小种的新的r基因的威胁，还需要寻找广谱(大部分/全部小种)且更为持久的替代抗性。4、菠菜育种者的目标在于迅速开发出对包括最近鉴定的小种在内的尽可能多的霜霉属小种具有抗性的菠菜品种。目前，19个pe小种受到正式承认，公众可从阿肯色大学植物病理学系(费耶特维尔，ar 72701，美国)以及从荷兰nak tuinbouw，sotaweg 22，2371 gdroelofarendsveen获得。已在某些地区鉴定到pe.20，并且预计将持续产生散展霜霉的其他小种。技术实现思路1、在本文中，提供了可用于鉴定和选择植物疾病易感基因或“s基因”的组合物和方法。上述组合物和方法可用于通过化学诱变、选择具有疾病抗性的植株、创建转基因抗性植株和/或创建具有抗性的基因组编辑植株，从而产生抗性植株。本文还提供了与对照植株相比具有新获得的或增强的对各种植物疾病抗性的植株。在一些实施方式中，组合物和方法可用于通过化学诱变、选择具有霜霉病(dm)疾病抗性的菠菜植株、创建转基因dm抗性菠菜植株和/或创建具有dm抗性的基因组编辑的菠菜植株，从而产生抗性植株。2、抗dm菠菜植株可以与第二菠菜植株杂交以获得具有抗性基因等位基因的子代菠菜植株。相对于不含有利的等位基因的对照植株，疾病抗性可以是新获得的或增强的。dm抗性基因等位基因可以进一步细化至通过标记物确定并包含确定标记物的染色体区间。在一些实施方式中，示出了用于鉴定和/或选择抗dm植株的方法。在这些方法中，分析菠菜植株的dna在与dm抗性关联的4号染色体上是否存在抗性基因等位基因，其中，所述抗性基因等位基因在spov3_chr4_93275081(参考序列seq id no：241的101位)包含“t”、在spov3_chr4_105049870(参考序列seq id no：242的101位)包含“a”、在spov3_chr4_107241402(参考序列seq id no：243的101位)包含“a”、在spov3_chr4_109546568(参考序列seq id no：244的101位)包含“a”、在spov3_chr4_109698808(参考序列seq id no：245的101位)包含“a”、在spov3_chr4_112008390(参考序列seq id no：246的101位)包含“a”、在spov3_chr4_112574123(参考序列seq id no：247的101位)包含“t”、在spov3_chr4_117783935(参考序列seq id no：248的101位)包含“t”、在spov3_chr4_118191085(参考序列seq id no：249的101位)包含“a”、在spov3_chr4_118788268(参考序列seq id no：250的101位)包含“a”或在spov3_chr4_121142541(参考序列seq id no：251的101位)包含“a”，并且如果检测到所述抗性基因等位基因，则将植株鉴定和/或选择为具有dm抗性。3、在一些实施方式中，用于鉴定和/或选择具有dm抗性的植株的方法包括：检测或选择包含seq id no：1，seq id no：93，或seq id no：169的基因组区段。相对于不含有利的等位基因的对照植株，dm抗性可以是新赋予的或增强的。在一个实施方式中，dm抗性区段包含赋予或增强对dm的抗性的网格蛋白适配体中亚基蛋白的编码基因。在一些实施方式中，网格蛋白适配体中亚基蛋白包含如seq id no：3所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，dm抗性区段包含赋予或增强对dm的抗性的含三角状五肽重复蛋白(pentatricopeptiderepeat-containing protein)的编码基因。在一些实施方式中，含三角状五肽重复蛋白包含如seq id no：95所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，dm抗性区段包含赋予或增强对dm的抗性的编码rps2样抗性蛋白的基因。在一些实施方式中，rps2样抗性蛋白包含如seqid no：171所示的氨基酸序列。4、在另一个实施方式中，提供了鉴定和/或选择具有dm抗性的植株的方法，其中在植物中检测到与以下任何一个连锁并关联的一个以上标记物等位基因：spov3_chr4_93275081(参考序列seq id no：241的101位)处的“t”、spov3_chr4_105049870(参考序列seq id no：242的101位)处的“a”、spov3_chr4_107241402(参考序列seq id no：243的101位)处的“a”、spov3_chr4_109546568(参考序列seq id no：244的101位)处的“a”、spov3_chr4_109698808(参考序列seq id no：245的101位)处的“a”、spov3_chr4_112008390(参考序列seq id no：246的101位)处的“a”、spov3_chr4_112574123(参考序列seq id no：247的101位)处的“t”、spov3_chr4_117783935(参考序列seq id no：248的101位)处的“t”、spov3_chr4_118191085(参考序列seq id no：249的101位)处的“a”、spov3_chr4_118788268(参考序列seq id no：250的101位)处的“a”或spov3_chr4_121142541(参考序列seq id no：251的101位)处的“a”，并且选择具有一个以上标记物等位基因的植株。一个以上标记物等位基因可以在基于单次减数分裂的遗传图谱上以10cm、9cm、8cm、7cm、6cm、5cm、4cm、3cm、2cm、1cm、0.9cm、0.8cm、0.7cm、0.6cm、0.5cm、0.4cm、0.3cm、0.2cm或0.1cm以下的图距连锁。所选的植株可以与第二植株杂交，以获得具有与以下任何一个连锁并相关的一个以上标记物等位基因的子代植株：spov3_chr4_93275081(参考序列seq id no：241的101位)处的“t”、spov3_chr4_105049870(参考序列seq id no：242的101位)处的“a”、spov3_chr4_107241402(参考序列seq id no：243的101位)处的“a”、spov3_chr4_109546568(参考序列seq id no：244的101位)处的“a”、spov3_chr4_109698808(参考序列seq id no：245的101位)处的“a”、spov3_chr4_112008390(参考序列seq id no：246的101位)处的“a”、spov3_chr4_112574123(参考序列seq id no：247的101位)处的“t”、spov3_chr4_117783935(参考序列seq id no：248的101位)处的“t”、spov3_chr4_118191085(参考序列seq id no：249的101位)处的“a”、spov3_chr4_118788268(参考序列seq id no：250的101位)处的“a”或spov3_chr4_121142541(参考序列seq id no：251的101位)处的“a”。5、在另一实施方式中，在此示出了将与dm抗性关联的基因等位基因进行渗入的方法。在这些方法中，用一个以上标记物筛选植物种群，以确定任何植株是否具有与dm抗性关联的基因等位基因，并且从种群中选择至少一个具有与dm抗性关联的基因等位基因的植株。基因等位基因在spov3_chr4_93275081(参考序列seq id no：241的101位)包含“t”、在spov3_chr4_105049870(参考序列seq id no：242的101位)包含“a”、在spov3_chr4_107241402(参考序列seq id no：243的101位)包含“a”、在spov3_chr4_109546568(参考序列seq id no：244的101位)包含“a”、在spov3_chr4_109698808(参考序列seq id no：245的101位)包含“a”、在spov3_chr4_112008390(参考序列seq id no：246的101位)包含“a”、在spov3_chr4_112574123(参考序列seq id no：247的101位)包含“t”、在spov3_chr4_117783935(参考序列seq id no：248的101位)包含“t”、在spov3_chr4_118191085(参考序列seq id no：249的101位)包含“a”、在spov3_chr4_118788268(参考序列seq id no：250的101位)包含“a”或在spov3_chr4_121142541(参考序列seq id no：251的101位)包含“a”。6、在一些实施方式中，可以通过标记物辅助的性状渗入、转基因或基因编辑(包括基因替换或等位基因替换)手段来实现将具有dm抗性的基因从抗性品系引入易感品系。7、通过本发明实施的方法涉及：用于转化包括植物细胞在内的宿主细胞的方法，包括用本发明的一个实施方式的多核苷酸转化宿主细胞；用于产生植株的方法，包括用本发明的一个实施方式的重组dna构建体转化植物细胞并由转化的植物细胞再生植株；以及赋予或增强疾病抗性的方法，包括用本文所公开的重组dna构建体转化植物。8、在一个实施方式中，提供了改变能够在植物或植物细胞中赋予疾病抗性的蛋白的表达水平的方法，其中，所述方法包括用本文所公开的重组dna构建体转化植物细胞并在适合重组dna构建体表达的条件下培养转化的植物细胞，其中，重组dna构建体的表达导致产生能够在转化的宿主中赋予疾病抗性的蛋白的表达水平的改变。9、在本文中，提供了改变植物疾病抗性的方法，所述方法包括通过靶向植物的一个基因座处的dna断裂引入一个以上核苷酸修饰，其中，基因座包含编码网格蛋白适配体中亚基蛋白、含三角状五肽重复序列的家族蛋白或rps2样抗性蛋白的参与疾病抗性的s基因，并且其中，与不含一个以上引入的遗传修饰的对照植株相比，植物疾病抗性发生改变。在某些实施方式中，s基因包含与选自seq id nos：4、7-34、96、99-121、172、175-196、252-270、316-320和331的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，或编码包含与选自seq id nos：6、64-92、98、145-168、174、219-240、294-315、326-330和333的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，靶向的dna修饰靶向多于一个不同的参与植物疾病抗性的基因座。10、在某些实施方式中，靶向的dna修饰选自由插入、缺失、单核苷酸多态性(snp)和多核苷酸修饰组成的组，从而改变(提高或降低)s基因编码的多肽的表达。在某些实施方式中，靶向的dna修饰导致以下一个以上：s基因的表达变化(提高或降低)；产生一个以上s基因的可变剪接转录本；诸如缺失一个以上dna结合域的变化；s基因的一个以上外显子中的移码突变；诸如缺失s基因的大部分或缺失s基因的全长开放阅读框的变化；诱导或抑制存在于编码s基因的调控区内的增强子基序；修饰一个以上核苷酸或者诸如缺失与s基因表达可操作地相连的调控元件的变化，其中，调控元件存在于启动子、内含子、3’utr、终止子或其组合内。在某些实施方式中，靶向的dna修饰靶向s基因的基因座，使得一个以上核苷酸修饰存在于编码参与疾病抗性并显著提高相容性的多肽的内源多核苷酸的(a)同一编码区；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非翻译区，或(e)(a)-(d)的任何组合。11、在某些实施方式中，靶向的dna修饰通过rna引导的核酸内切酶、位点特异性脱氨酶或位点特异性核酸内切酶引入，靶向的dna修饰通过选自由多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、工程位点特异性大范围核酸酶或阿戈诺特(argonaute)组成的组的基因组修饰技术进行。在某些实施方式中，靶向的dna修饰通过使用与靶向序列对应的向导rna引入，靶向序列包含与选自seq id nos：4、7-34、96、99-121、172、175-196、252-270、316-320和331的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多核苷酸，或编码包含与选自seq id nos：6、64-92、98、145-168、174、219-240、294-315、326-330和333的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，当靶向的dna修饰导致s基因编码的蛋白的表达或活性改变时，植株表现出提高的疾病抗性。在某些实施方式中，植株为菠菜植株。在某些实施方式中，疾病为霜霉病。12、本文还提供了表现出增强的疾病抗性的包含修饰的包含参与疾病抗性的s基因的基因座的植株，其中，与对照植株相比，基因座包含一个以上引入的突变，并且其中，基因座包含与选自seq id nos：4、7-34、96、99-121、172、175-196、252-270、316-320和331的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多核苷酸，或编码包含与选自seq id nos：6、64-92、98、145-168、174、219-240、294-315、326-330和333的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。13、本文还提供了重组dna构建体，其包含与选自seq id nos：4、7-34、96、99-121、172、175-196、252-270、316-320和331的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多核苷酸，或编码包含与选自seq id nos：6、64-92、98、145-168、174、219-240、294-315、326-330和333的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸与至少一个异源核酸序列可操作地相连。14、此外，本文提供了包含重组dna构建体的植物细胞，重组dna构建体包含与选自seqid nos：4、7-34、96、99-121、172、175-196、252-270、316-320和331的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多核苷酸，或编码包含与选自seq id nos：6、64-92、98、145-168、174、219-240、294-315、326-330和333的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸与至少一个异源核酸序列可操作地相连。15、本文提供了靶向植物细胞的基因座的向导rna序列，其中，基因座包含与选自seqid nos：4、7-34、96、99-121、172、175-196、252-270、316-320和331的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的多核苷酸，或编码包含与选自seq id nos：6、64-92、98、145-168、174、219-240、294-315、326-330和333的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，向导rna存在于重组dna构建体中。16、在公开了多个实施方式的同时，对技术领域的技术人员而言，本发明的其他实施方式将通过示出并描述本发明的说明性实施方式的以下详细说明而变得显而易见。因此，附图和详细说明将在本质上视作说明性的而非限制性的。