一种制备玉米单倍体的方法

本发明属于生物，具体涉及一种制备玉米单倍体的方法。背景技术：1、常规玉米单倍体育种的基本程序是以单倍体诱导系为父本与普通母本材料杂交获得单倍体，然后通过加倍，形成双单倍体纯系；这种诱导系叫玉米母本单倍体诱导系。stock6是发现的第一个玉米母本单倍体诱导系，利用stock6来源的诱导系几乎在所有母本材料上都能获得一定比例的单倍体，各国育种家以此为基础选育出大量优良的诱导系，诱导率也不断提升。2、目前，虽然调控玉米母本单倍体诱导系的一些基因已被鉴定，但仍然存在以下问题亟待解决：第一，基因突变往往会导致植株生长变弱、花粉发育、萌发或者受精作用异常，影响结实率，从而降低单倍体诱导效率；第二，检测雄性不育是快速鉴定单倍体的重要方法，但基因突变导致的雄性不育表型会干扰单倍体的鉴定。因此，建立其它制备玉米单倍体的方法具有重要的应用前景。技术实现思路1、本发明的目的为制备玉米单倍体。2、本发明首先保护一种制备玉米单倍体的方法，可包括如下步骤：3、(1)降低二倍体玉米甲中蛋白质zmgex1的活性和/或表达量，得到转基因玉米；4、所述蛋白质zmgex1为(a1)、(a2)或(a3)：5、(a1)氨基酸序列如seq id no：3所示的蛋白质；6、(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；7、(a3)将(a1)或(a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与玉米倍性相关的蛋白质；8、(2)完成步骤(1)后，将所述转基因玉米进行自交或作为母本与二倍体玉米乙杂交，得到后代；9、(3)完成步骤(2)后，从后代中分离玉米单倍体。10、上述(a2)中，标签具体如表1所示。11、表1.标签的序列12、 标签 残基 序列 poly-arg 5-6(通常为5个) rrrrr poly-his 2-10(通常为6个) hhhhhh flag 8 dykddddk strep-tagii 8 wshpqfek c-myc 10 eqkliseedl ha 9 ypydvpdya 13、上述方法中，所述降低二倍体玉米甲中蛋白质zmgex1的活性和/或表达量通过突变二倍体玉米甲一条同源染色体上的蛋白质zmgex1的编码基因，另一条同源染色体上的蛋白质zmgex1的编码基因保持不变来实现。14、上述方法中，所述“突变二倍体玉米甲一条同源染色体上的蛋白质zmgex1的编码基因，另一条同源染色体上的蛋白质zmgex1的编码基因保持不变”可为将二倍体玉米甲一条同源染色体上的seq id no：2所示的zmgex1基因突变为zmgex1/g-a基因，另一条同源染色体上的seq id no：2所示的zmgex1基因保持不变；所述zmgex1/g-a基因是将seq id no：2自5’末端起第18位的g变为a，保持seq idno：2的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。15、上述方法中，所述突变二倍体玉米甲一条同源染色体上的蛋白质zmgex1的编码基因通过ems诱变、t-dna插入、rna干扰、同源重组、基因定点编辑、锌指核酸酶或转录激活子样效应因子核酸酶，使蛋白质zmgex1的编码基因的外显子发生错义突变实现。16、上述任一所述蛋白质zmgex1的编码基因可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)的dna分子：17、(b1)编码区如seq id no:2所示的dna分子；18、(b2)核苷酸序列如seq id no:2所示的dna分子；19、(b3)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna分子；20、(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质zmgex1的dna分子；21、(b5)来源于玉米且与(b1)或(b2)或(b3)限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同一性且编码所述蛋白质zmgex1的dna分子。22、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质zmgex1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质zmgex1的核苷酸序列70％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质zmgex1，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。23、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码seq id no:3所示的氨基酸序列组成的所述蛋白质zmgex1的核苷酸序列具有70％或更高，或75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。24、上述任一所述二倍体玉米甲可为玉米自交系b73。25、上述任一所述二倍体玉米乙可为玉米自交系b73。26、上述任一所述方法中，所述转基因玉米可为zmgex1+/-杂合突变体；与玉米自交系b73基因组相比，zmgex1+/-杂合突变体的区别点仅在于一条同源染色体上seq id no：2所示的zmgex1基因不变，另一条同源染色体上的zmgex1基因突变为zmgex1/g-a基因；所述zmgex1/g-a基因是将seq id no：2自5’末端起第18位的g变为a，保持seq id no：2的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。27、在本发明的实施例中，zmgex1+/-杂合突变体的制备方法依次可如下：28、①播种玉米购自ems诱变突变体库的zmgex1+/-突变体(mutant id为：ems4-0999b1)种子，常规培养，得到玉米植株。提取玉米植株的叶片的基因组dna并作为模板，采用引物check-f：5’-tgatgcccttcaattcgctgtt-3’和引物check-r：5’-gggaggagaagatgttccacgaga-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；29、②将步骤①得到的pcr扩增产物进行测序。测序结果与zmgex1基因(seq id no：1自5’末端起第805-1046位所示的dna片段)进行比对，挑选杂合突变株；杂合突变株指的是该植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的zmgex1基因(核苷酸序列如seq id no：1所示)发生了突变、另一条同源染色体的zmgex1基因未发生突变；30、zmgex1基因发生了突变具体可为在zmgex1基因的编码区发生了1个核苷酸的突变，具体的seq id no：1自5’末端起第967位的g突变为a，从而编码色氨酸(trp)的密码子tgg突变为终止密码子tga，导致蛋白质zmgex1的翻译提前终止；31、③将步骤②得到的杂合突变株(作为母本)与玉米b73(作为父本)回交，得到f1代种子；播种f1代种子，常规培养，得到玉米植株。提取玉米植株的叶片的基因组dna并作为模板，采用引物check-f：5’-tgatgcccttcaattcgctgtt-3’和引物check-r：5’-gggaggagaagatgttccacgaga-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。将该pcr扩增产物进行测序。测序结果与zmgex1基因(seq id no：1自5’末端起第805-1046位所示的dna片段)进行比对，根据比对结果从中筛选获得f1—杂合突变体；32、f1—杂合突变体的一条同源染色体的zmgex1基因未发生突变，另一条同源染色体上在zmgex1基因的编码区发生了1个核苷酸的突变，具体的seq id no：1自5’末端起第967位的g突变为a；33、④将步骤③得到的f1—杂合突变体(作为母本)与玉米b73(作为父本)回交，得到f2代种子；播种f2代种子，常规培养，得到玉米植株。提取玉米植株的叶片的基因组dna并作为模板，采用引物check-f：5’-tgatgcccttcaattcgctgtt-3’和引物check-r：5’-gggaggagaagatgttccacgaga-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。将该pcr扩增产物进行测序。测序结果与zmgex1基因(seq id no：1自5’末端起第805-1046位所示的dna片段)进行比对，根据比对结果从中筛选获得f2—杂合突变体；34、f2—杂合突变体的一条同源染色体的zmgex1基因未发生突变，另一条同源染色体上在zmgex1基因的编码区发生了1个核苷酸的突变，具体的seq id no：1自5’末端起第967位的g突变为a；35、⑤将步骤④得到的f2—杂合突变体进行自交繁种，得到f3代种子；播种f3代种子，常规培养，得到玉米植株。提取玉米植株的叶片的基因组dna并作为模板，采用引物check-f：5’-tgatgcccttcaattcgctgtt-3’和引物check-r：5’-gggaggagaagatgttccacgaga-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。将该pcr扩增产物进行测序。测序结果与zmgex1基因(seq id no：1自5’末端起第805-1046位所示的dna片段)进行比对，根据比对结果从中筛选获得zmgex1+/-杂合突变体；36、与玉米自交系b73基因组相比，zmgex1+/-杂合突变体的区别点仅在于一条同源染色体的zmgex1基因未发生突变，另一条同源染色体上在zmgex1基因的编码区发生了1个核苷酸的突变，具体的seq id no：1自5’末端起第967位的g突变为a。37、上述任一所述的方法在提高玉米单倍体育种效率中的应用也属于本发明范围。38、上述任一所述的方法制备的玉米单倍体在提高玉米单倍体育种效率中的应用也属于本发明范围。39、上述任一所述转基因玉米或上述任一所述蛋白质zmgex1在制备玉米单倍体中的应用也属于本发明范围。40、上述任一所述转基因玉米或上述任一所述蛋白质zmgex1在提高玉米单倍体育种效率中的应用也属于本发明范围。41、实验证明，将通过降低二倍体玉米中蛋白质zmgex1的活性和/或表达量得到的转基因玉米进行自交或作为母本与二倍体玉米杂交，后代中均可分离获得玉米单倍体。本发明首次利用蛋白质zmgex1制备玉米单倍体，避免了诱导系长势弱和育性差的表型，且可通过自交制备单倍体，完整保留作物优良性状。采用本发明的方法能够制备玉米单倍体且单倍体诱导率较高。本发明具有重要的应用价值。