一种百香果超低温脱毒方法及脱毒苗快速繁殖的

本发明涉及茎尖脱毒，特别是涉及一种百香果超低温脱毒方法及脱毒苗快速繁殖的方法。背景技术：1、百香果（passiflora edulis sims），西番莲科西番莲属藤本植物，学名鸡蛋果。喜光，喜富含有机质、疏松、土层深厚、排水良好的土壤。近年来，百香果产业成为了一些地区振兴发展的主导产业，但大规模种植以及传统的无性繁殖导致病毒病、茎基腐病等病害越来越严重，其中马铃薯y病毒属病毒对百香果的生长危害尤为明显。此外，目前广泛应用的嫁接和扦插的繁殖方法在保护种源、提高种苗扩繁效率方面遇到了很大瓶颈。因此，必须研究出新培育无毒害、适应大规模种植的百香果的方法，以促进百香果种植产业持续健康的发展，适应新时代高质量发展的要求。2、超低温脱毒法是近年来建立的利用超低温对含病毒细胞的选择性破坏的一种新型脱毒技术，其原理是茎尖顶端的分生组织细胞内不含病毒或含有很少的病毒，距离分生组织越远的细胞，其病毒的含量越大；远离分生组织的细胞液泡较大，细胞液中含有较多的水分，在超低温（-80℃以下）保存过程中易形成冰晶致死；而分生组织细胞含水量少，抗冻性强，受冻后相对容易存活。为进一步保证茎尖分生组织的存活率，在超低温处理前一般使用复合玻璃化溶液（pvs2）处理以减少对植物细胞的伤害，复合玻璃化溶液一方面使细胞中的液态物质经快速冷却，不生成晶体结构，直接转变为玻璃化的固体状态；另一方面，溶液中包含的蔗糖能够降低细胞内的含水量，以增强细胞的抗冻性，提高存活率。与传统的茎尖脱毒方法相比较，茎尖超低温脱毒不受茎尖大小限制，具有操作简便、脱毒率高、脱毒苗生产周期短等优点。3、但是，由于植物品种不同，其组织特性、含水量以及对超低温的耐受程度相应地有所不同，因此，需要针对不同植物品种需要分别建立合适的实验程序，分别建立超低温脱毒体系。目前，茎尖超低温脱毒法在多种植物上已有应用，但是，由于百香果生长于热带或亚热带环境，百香果细胞较其他植物细胞难以适应低温环境，其茎尖超低温脱毒及脱毒苗高效快繁体系建立的成功率低：得到的再生植株健壮程度不一，部分叶片黄化，存在均一性较差的问题；还存在脱毒组培苗在进一步的增殖培养中扩繁效率低的问题，这些问题阻碍了百香果脱毒组培苗在商业上的大规模推广应用。因此，需要建立合适的百香果超低温脱毒体系以减弱超低温处理给茎尖带来的不良影响，并进一步结合高效组培苗快繁体系以提高百香果组培苗的扩繁效率。技术实现思路1、基于此，提供一种百香果超低温脱毒方法，包括以下步骤：2、步骤s1：切取百香果茎尖，洗净消毒后进行高糖预培养处理，再放入高渗溶液中培养，得到失水的茎尖；3、步骤s2：将失水的茎尖放入在wpm基础培养基中加入甘油、peg和dmso所形成的超低温保护液中脱水处理，得到脱水的茎尖；4、步骤s3：将脱水的茎尖在液氮条件下超低温脱毒处理；5、步骤s4：将超低温脱毒处理后的茎尖进行复水处理，再转接至恢复培养基上恢复培养，得到脱毒茎尖。6、本发明所述的百香果超低温脱毒方法具有脱毒率高、茎尖存活率高的优点。7、进一步地，所述超低温保护液还加入有甘露醇。8、进一步地，所述超低温保护液中向wpm基础培养基中加入的物质比例为：甘油30%、peg 15%、dmso 15%和甘露醇20%。9、进一步地，所述高糖预培养的步骤包括：将百香果茎尖放入在wpm基础培养基加入蔗糖所形成的预培养基中培养。10、进一步地，所述高渗溶液是在wpm基础培养基中加入甘油和蔗糖所形成的。11、进一步地，所述复水处理的步骤包括将脱水的茎尖快速解冻，再放入在wpm基础培养基加入蔗糖所形成的复水保护液中。12、进一步地，所述恢复培养基是在wpm基础培养基中加入ga3和6-ba所形成的。13、进一步地，提供一种百香果脱毒苗快速繁殖的方法，包括以下步骤：将脱毒茎尖接种到增殖培养基中培养；再转接到生根培养基培养，其中，所述增殖培养基是在wpm基础培养基中加入6-ba、kt和活性炭所形成的；所述生根培养基是在wpm基础培养基中加入6-ba和naa所形成的。该方法具有扩繁效果好的优点。14、进一步地，所述增殖培养基还加入有香蕉泥。15、进一步地，对百香果超低温脱毒的步骤：16、步骤s1：切取1-2mm百香果茎尖，用3%的海藻酸钠将百香果茎尖包裹，滴入100~150mm浓度为0.5~2 mg/ml的氯化钙溶液制备成3-4mm的茎尖小球洗净消毒后，放入预培养基进行高糖预培养处理12~48h，再放入渗透保护培养基中培养20~30min，得到失水的茎尖；17、所述预培养基是在wpm基础培养基加入0.4~0.6m蔗糖形成的；所述渗透保护培养基是在wpm基础培养基加入1~3m甘油和0.4~0.6m蔗糖形成的；18、步骤s2：将失水的茎尖放入超低温保护液中脱水处理30~50min，得到脱水的茎尖；19、步骤s3：将脱水的茎尖在液氮条件下超低温脱毒处理12~48h；20、步骤s4：将超低温脱毒处理后的茎尖放置在37℃热水浴中快速解冻1~4min，再放置在复水保护液中进行复水处理20~30min，然后转接至恢复培养基上恢复培养暗培养5~10d，再转接到新鲜的恢复培养基上光培养20~28d，得到脱毒茎尖；21、所述复水保护液是在wpm基础培养基加入0.4~2m蔗糖形成的；所述恢复培养基是在wpm基础培养基加入0.03~0.08mg/l ga3和2~5mg/l 6-ba形成的；22、百香果脱毒苗快速繁殖的步骤：23、步骤s5：将脱毒茎尖接种到增殖培养基中增殖培养30~50d，培养条件为20~30℃，光强3500~5000lx，光周期12/12h~8/16h，得到脱毒组培苗；将脱毒组培苗转接到生根培养基进行生根培养；24、所述增殖培养基是在wpm基础培养基加入2~5mg/l 6-ba、0.5~2mg/l kt、0.3~0.8g/l活性炭、5~6g/l琼脂粉形成的；所述生根培养基是在wpm基础培养基加入0.3~0.8mg/l 6-ba、0.1~0.3mg/l naa、5~6g/l琼脂粉形成的。25、为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。技术特征：1.一种百香果超低温脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：2.根据权利要求1所述的百香果超低温脱毒方法，其特征在于：所述超低温保护液还加入有甘露醇。3. 根据权利要求2所述的百香果超低温脱毒方法，其特征在于：所述超低温保护液中向wpm基础培养基中加入的物质比例为：甘油30%、peg 15%、dmso 15%和甘露醇15~25%。4.根据权利要求3所述的一种百香果超低温脱毒方法，其特征在于：所述高糖预培养的步骤包括：将百香果茎尖放入在wpm基础培养基加入蔗糖所形成的预培养基中培养。5.根据权利要求4所述的一种百香果超低温脱毒方法，其特征在于：所述高渗溶液是在wpm基础培养基中加入甘油和蔗糖所形成的。6.根据权利要求5所述的一种百香果超低温脱毒方法，其特征在于：所述复水处理的步骤包括将脱水的茎尖快速解冻，再放入在wpm基础培养基加入蔗糖所形成的复水保护液中。7.根据权利要求6所述的一种百香果超低温脱毒方法，其特征在于：所述恢复培养基是在wpm基础培养基中加入ga3和6-ba所形成的。8.一种百香果脱毒苗快速繁殖的方法，其特征在于：将根据权利要求1-7任一项所述的百香果超低温脱毒方法得到的脱毒茎尖接种到增殖培养基中培养；再转接到生根培养基培养，其中，所述增殖培养基是在wpm基础培养基中加入6-ba、kt和活性炭所形成的；所述生根培养基是在wpm基础培养基中加入6-ba和naa所形成的。9.根据权利要求8所述的百香果脱毒苗快速繁殖的方法，其特征在于：所述增殖培养基还加入有香蕉泥。10.根据权利要求9所述的百香果脱毒苗快速繁殖的方法，其特征在于：技术总结本发明涉及一种百香果超低温脱毒方法及脱毒苗快速繁殖的方法，包括以下步骤：切取百香果茎尖进行高糖预培养处理和高渗溶液中培养后得到失水的茎尖；将失水的茎尖放入超低温保护液中脱水处理得到脱水的茎尖；超低温条件下处理脱水的茎尖复水处理再转接至恢复培养基上培养；将恢复培养后的茎尖接种到增殖培养基中培养；最后转接到生根培养基培养。本发明所述的一种百香果超低温脱毒方法及脱毒苗快速繁殖的方法具有脱毒率高、茎尖存活率高、扩繁效果好的优点。技术研发人员：王亚金,张连娟,万阳,张方园受保护的技术使用者：云南龙藏生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/5/12