一种构建飞蝗雄虫体色Marker基因Yellow Protein纯合突

本发明属于基因工程，涉及病虫害防治，特别是指一种构建飞蝗雄虫体色marker基因 yellow protein纯合突变体的方法及其应用。 背景技术：1、东亚飞蝗（ locusta migratoria）隶属于直翅目orthoptera，蝗总科acridoidea，斑翅蝗科oedipodidae，飞蝗属locusta linnaeus，是我国重要的农业害虫，也是引起蝗灾的主要害虫。东亚飞蝗是一种半变态昆虫，世代周期分为卵期，若虫期和成虫期，成虫具有群居迁飞行为，若虫和成虫主要取食禾本科和莎草科植物，如玉米，谷子等植物。 2、蝗灾是世界性长期广泛发生的农业生物灾害，全球近一半国家和陆地遭受蝗灾的危害，给粮食生产，森林和牧场以及人民健康造成极大的损失，其中非洲和亚洲等国家的蝗灾危害更为频繁和严重。3、目前防治的东亚飞蝗的主要措施仍是化学农药，多采用有机磷农药，拟除虫菊酯和氟虫氰等杀虫剂，虽然化学防治具有快速、高效、操作方便等优点，但长期使用化学农药，使得东亚飞蝗产生了严重的抗药性，大幅降低了化学农药的防治效果，导致粮食及蔬菜瓜果的药物残留急剧上升，这不仅降低了农作物的产量和质量，更严重危害了人们的身体健康。所以东亚飞蝗迫切需要新的无公害防治方法。4、害虫种群的遗传调控技术（genetic regulation technique，grt）是利用害虫自身生长发育的关键基因，采用性别控制开关，通过遗传转化使雄虫成为携带导致后代雌虫发育异常或雌性不育的遗传控制复体（性别开关元件和靶标基因的复合体）。遗传调控技术是未来害虫防治的方向。基因组编辑技术是目前昆虫基因功能研究的重要手段，利用基因组编辑技术筛选并研究靶标基因功能，从而构建东亚飞蝗遗传调控品系，为防治东亚飞蝗提供理论和应用价值，为农业害虫的防治奠定基础。基于基因编辑和转基因的飞蝗遗传调控技术是绿色防控飞蝗的研究方向， yp作为飞蝗体色发育中的关键基因，其基因功能影响着飞蝗正常的求偶交配功能，也是雌雄特异性表达的基因，在飞蝗雌雄害虫特异性防治中具有潜在应用价值。 5、目前昆虫遗传调控技术是未来害虫绿色防控的发展方向之一，而飞蝗作为世界性迁飞重大农业害虫缺乏遗传调控技术方面的探索和研究；公开号为cn113981008a的申请公开了一种制备飞蝗lmzen纯合突变体的方法、rnp复合物及应用，lmzen基因为参与浆膜细胞多核化、浆膜表皮形成和表皮几丁质合成酶基因表达等多个过程的基因，而干扰lmzen基因的表达回明显影响飞蝗表皮、形态的生长发育并进一步死亡以及卵的发育；该专利干扰lmzen基因表达后带来的是当代飞蝗的死亡；为进一步挖掘飞蝗中的关键基因，筛选适宜绿色防治的飞蝗基因，本课题组进行深入的研究。技术实现思路1、为解决上述技术问题，本发明提出一种构建飞蝗雄虫体色marker基因 yellow  protein纯合突变体的方法及其应用，本技术通过飞蝗 yp基因纯合体的构建，验证了飞蝗雄虫求偶交配中必要功能基因，为飞蝗的绿色防控奠定了技术基础。 2、本发明的技术方案是这样实现的：3、一种构建飞蝗雄虫体色marker基因 yellow protein（ yp）纯合突变体的方法，包括以下步骤： 4、（1）观察飞蝗羽化后成虫体色，发现雄虫特异性的变黄，雌虫无此特，利用race技术扩增克隆了飞蝗 yp基因序列，并验证 yp的表达趋势； 5、（2）在飞蝗 yp基因序列2和5号外显子设计sgrna靶标序列，通过体外转录合成靶点sgrna，与cas9蛋白体外融合行程rnp混合物，利用飞蝗胚胎显微注射平台将rnp混合物注入飞蝗卵中； 6、（3）对飞蝗突变个体提取基因组，利用靶点检测引物，对靶点进行pcr，并送公司进行测序；确认突变个体后，让其与野生型个体进行杂交，得到g1代，利用同样的检测步骤确认g1代突变个体，g1代突变个体与野生型个体进行杂交后，得到g2代个体，g2代个体突变检测成功后，让雌雄突变类型一致的个体进行自交，得到g3代个体，通过检测筛选g3个体中纯合突变体，自交后得到 yp纯合突变体种群。 7、上述步骤（1）中飞蝗 yellow protein基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。 8、上述 yp基因2号外显子靶点的核苷酸序列如seq id no.2所示：5’-cctcacggtgcagctcgacgacc -3’； yp基因5号外显子靶点的核苷酸序列如seq id no.3所示：5’- ccgcagacgtcgaacccggcagc-3’。 9、上述步骤（2）中显微注射首先利用体外转录sgrna与cas9蛋白进行注射，终浓度均为300 ng/μl，注射到飞蝗刚产下少于1h的卵中，培养的条件为温度33±1℃，相对湿度40%。10、上述步骤（3）中靶点检测引物如下：11、lmyp-gf的核苷酸序列如seq id no.4所示：5’- tggagaccgcagctgccatc-3’；12、lmyp-gr的核苷酸序列如seq id no.5所示：5’- cggcttcaggtcctgcacca-3’。13、上述突变检测成功指sgrna靶标位点处存在双峰的基因。14、本技术还针对或的的纯合突变体进行以下检测：15、①利用qpcr和western blot对纯合突变体进行 yp表达量检测，确认 yp基因功能缺失。 16、②对纯合突变个体进行拍照观察，利用生测实验验证 yp纯合体求偶交配行为。 17、利用上述方法构建的飞蝗 yellow protein纯合突变体在防治飞蝗病虫害中的应用。 18、飞蝗 yellow protein基因在制备交配欲望低的雄性飞蝗中的应用。 19、飞蝗 yellow protein基因作为飞蝗marker基因中的应用，通过使飞蝗缺失 yellow  protein基因，得到呈现黄色体色的雄性飞蝗。 20、本发明具有以下有益效果：21、1、飞蝗（locusta migratoria）是重要的农业害虫，自古以来对我国乃至世界农业生产造成巨大损失。飞蝗为我国重大农作物害虫，是农业农村部2023年发布的《一类农作物病虫害名录》中十大虫害之一。飞蝗缺乏行之有效的害虫防治防控方法，随着基因编辑和转基因技术的不断发展和应用，基于基因编辑技术构建飞蝗基因突变纯合品系，为飞蝗的绿色防控提供潜在借鉴和应用价值。22、2、基因编辑技术在昆虫基因功能研究中不断发展，已成为普遍应用的生物技术。而良好的marker基因是检测基因编辑效率的关键所在。飞蝗yp基因是雄虫特异性表达的体色发育基因，通过构建飞蝗yp纯合体，发现雄虫纯合体体色不发生变化，利于突变品系的筛选和维持，是表型明显的marker基因，同时也为其他昆虫的研究提供了选择。23、3、昆虫的求偶交配行为是昆虫繁衍后代，扩大种群所必须。 yp基因功能缺失导致雄虫在求偶交配欲望中显著低于野生型，导致yp纯合体交配成功率显著性降低。同时yp是雄虫特异性高表达的基因，暗示该基因对雄虫的重要性，该基因的缺失使得雄虫特异性的降低交配欲望，为飞蝗雄虫特异性遗传调控提供了靶标基因，也为其他害虫和非模式生物构建基因编辑纯合突变体提交技术思路。