一种提高人参和葛根合成生理活性物质的培养方

本发明属于生物，具体涉及一种提高人参和葛根合成生理活性物质的培养方法。背景技术：1、葛根(pueraria lobata)为豆科蝶形花亚科葛属多年生落叶藤本植物，全世界葛属植物共有30种左右；野葛，能加快血流循环和血液流动，有退热、透疹、升阳止泻、解酒等功效。目前，已从葛根中识别出70多种植物化学物质，按照其化学成分可分为异黄酮、三萜皂苷、香豆素和生物碱等几大类，一般认为异黄酮和三萜皂苷是葛根的主要活性成分。其中异黄酮类主要为葛根素、染料木素、芒柄花素等。葛根素因其有效的各种药理活性被广泛研究，其中包括心脏保护、血管舒张、心血管保护、抗炎、抗氧化、神经保护、减轻疼痛、促进骨形成、抑制酒精摄入、抗癌、肝保护、雌激素活性。实验和临床研究报道，葛根素也被广泛用于心血管疾病；糖尿病及其并发症；骨坏死和癌症的治疗。除此之外，葛根素可延缓胃排空，减缓酒精的吸收速率，降低肠壁通透性，保护胃肠道黏膜。同时，葛根素还可以调节乙醇代谢相关酶的活性，如乙醇脱氢酶和醛脱氢酶，选择性灭活细胞色素，从而减少自由基的产生，减轻肝细胞损伤；葛根素可提高体内抗氧化酶的活性，降低肝损伤引起的组织中的氧化应激。另外葛根淀粉在葛根中为主要食用成分，直链淀粉含量在葛根淀粉中约在19.8-60.5％之间，脂肪、蛋白质、灰分的含量均小于1％，还含有黄酮类物质如总黄酮、葛根素等，且富含有多种人体所必需的矿质元素(铁、磷、钙、锌、钾等)。2、人参(panax ginseng c.a.meyer)的化学成分主要包含皂苷类、糖类、挥发性成分、有机酸及其酯类、蛋白质、酶类、甾醇及其苷、多肽类、木质素、含氮化合物等。其中人参皂苷以及人参多糖作为主要药效成分在临床上应用较多。人参皂苷对于调节机体免疫及内分泌具有一定的活性。在特定条件下可升高或降低患者的血压、增强心脏功能的同时、也具有较强的护心作用。人参对于体虚者可兼具镇静安神以及醒神兴奋的功效。人参提物和许多兴奋药物可形成拮抗作用，对于中枢抑制药如水合氯醛的应用效果，可充分发挥其对抗作用。现代临床也经常将人参用于改善包括溃疡性结肠炎在内的多数疾病的异常免疫反应中。综上所述，人参作为保健食品中的一部分，对于调节人体免疫功能，镇静、护心等方面，发挥了充分的药理作用。3、随着对葛根和人参资源的开发利用不科学的采挖使野葛资源遭到严重破坏，一些优良的资源正在减少和消失。另外，因种植品种单一，资源保护、品种选育研究滞后，导致病虫害增加、种性退化、品质、抗性以及产量都不断下降。植物细胞、组织和器官的离体培养是进行种质创制的重要手段之一，而且可以不受时间和空间的环境限制，可用于药用植物中生物活性物质的高效生产。4、为此，通过葛根和人参两个物种不定根共培养方式，利用葛根组织细胞中的葛根素对人参不定根中稀有皂苷代谢相关酶的诱导和激活效应，可以改善和提高人参稀有皂苷的生物合成与积累；同时，人参分泌的皂苷类物质能够抑制葛根不定根的褐化程度、促进葛根不定根生长。因此，本发明能够提供一种提高人参和葛根生理活性物质合成含量、生产周期短、效率高的培养方法，而且葛根和人参共培养物还是一种优质的保健食品原料。技术实现思路1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种提高人参和葛根合成生理活性物质的培养方法，本发明利用人参和葛根的不定根共培养可以大幅度提高人参皂苷和葛根素含量，有利于活性物质的积累，另外，人参和葛根两种不定根组合，可作为保健品原料直接使用，用于食品、医药等行业，可以满足人们的需求。2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：3、一种提高人参和葛根合成生理活性物质的培养方法，所述培养方法为将人参和葛根进行不定根共培养。4、由于不同品种共培养时，品种间相互抑制生长，最终导致收获的细胞产量降低，但本发明通过筛选最佳组合，发现通过人参和葛根共培养不定根生物量较高，共培养可以大幅度提高人参皂苷和葛根素含量，有利于活性物质的积累。5、优选的，所述共培养采用的培养基为：以ms培养基为基础培养基，30-50g/l蔗糖，ph为5.8-6.5。6、本发明采用的改良ms液体基础培养基可实现人参和葛根不定根共培养，同时获得大量的药理活性物质。7、优选的，所述共培养采用的培养基为：以ms培养基为基础培养基，30-50g/l蔗糖、1.0-6.0mg/l iba、0.2-0.6mg/l naa、0.1-0.3mg/l kt，ph为5.6-6.0。8、本发明利用改良ms培养基为基础培养基，利用蔗糖以及葛根产生的淀粉为碳源，使用激素对不定根的生长进行调控；iba对于不定根的生长具有促进作用，5-7d不定根的根尖伸长区长出根毛，8-14d根毛明显增加，15-30d新生不定根迅速生长，31-40d生长速度缓慢，根部直径变粗；iba具有促进不定根生长的作用，有利于活性物质的积累合成iba和naa对不定根的生长发育都发挥作用，iba对不定根的分枝有促进伸长作用，naa对不定根的横向增粗生长有利，还可以使细胞重新愈伤化，并辅以kt进行组合。通过激素组合即可实现人参和葛根的不定根共培养时快速生长，解决了葛根中酚类物质含量高抑制不定根生长的问题，同时葛根次级代谢产物淀粉可在不定根生长过程为其提供碳源，大幅度提高人参皂苷和葛根素含量；且葛根素可以诱导人参皂苷合成过程中苯丙氨酸氨裂解酶(pal)、丝氨酸羧化酶(scl)、鲨烯环化酶(sqs)以及人参皂苷合成酶(gts)的表达，促进人参皂苷的积累，而sqs的催化产物是人参稀有皂苷rg3的合成的重要底物，所以本发明方法可以大幅度提高人参皂苷和葛根素含量。9、优选的，所述共培养采用的培养基为：以ms培养基为基础培养基，30g/l蔗糖、2.0mg/l iba、0.2mg/l naa、0.1mg/l kt，ph为5.8。10、本发明以葛根和人参的共培养不定根为研究对象，在三角瓶中进行液体悬浮培养，通过测定培养基中的人参总皂苷和葛根素含量及不定根的干重等变化情况，探明不定根生长及生理活性物质积累的动态变化规律，建立共培养不定根生长动力学模型，利用iba、naa、kt激素调控，促进目标物质在不定根中的积累。11、优选的，所述共培养的条件为：在24-26℃下摇床暗培养35-40d。12、优选的，所述摇床的转速为80-120rpm。13、优选的，所述人参不定根和所述葛根不定根的质量比为1:1-1.5，所述人参不定根和所述葛根不定根的总接种量为：每100ml所述培养基接种5-10g不定根。14、优选的，所述人参不定根的制备方法为：取3-5年生的新鲜人参根切段、消毒和淋洗后，置于人参不定根培养基在20-26℃下暗培养30-35d生出的人参不定根即可，接种量为每100ml所述人参不定根培养基接种5-10g，其中，所述人参不定根培养基为：1/2-1/4ms，30-50g/l蔗糖，1-5g/l葡甘聚糖，0.3-0.5％琼脂，1-5mg/l iba，0.2-0.6mg/lnaa，0.1-0.3mg/l kt，ph5.8-6.5；15、所述葛根不定根的制备方法为：取野生的新鲜葛根切段、消毒和淋洗后，置于培养基，置于葛根不定根培养基在20-26℃下暗培养30-35d生出的葛根不定根即可，接种量为每100ml所述葛根不定根培养基接种5-10g，其中，所述葛根不定根培养基为：以b5培养基为基础培养基，添加30-50g/l蔗糖，0.5-1％葛根粉，0.3-0.5％琼脂，1-5mg/l iba，0.2-0.6mg/lnaa，0.1-0.3mg/lkt，0.5-1％活性炭，ph5.8-6.5。16、本发明利用葛根粉制成天然培养基，为所要培养的不定根提供大量元素、微量元素及碳源；葛根粉所含的物质为葛根不定根中葛根素提供底物；另外，利用使用激素对不定根的生长进行调控，使其培养的目标产物更加安全可信。17、优选的，所述切段、消毒和淋洗的具体步骤为：切成1-2cm段，用70-75％酒精消毒10-20s，然后用0.1-0.5％氯化亚汞溶液消毒20-30min，再用无菌水淋洗3-5次即可。18、如上述所述的培养方法得到的葛根人参不定根产物。19、如上述所述葛根人参不定根产物在食品、保健品和制备药物领域中的应用。20、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：21、(1)本发明通过采用液体悬浮培养，共培养人参和葛根不定根收获的共培养不定根干重达5.34g/l，两种植物不定根进行共培养可以正常生长增殖，由于不同品种共培养时，品种间相互抑制生长，最终导致收获的细胞产量降低，但本发明通过筛选最佳组合，收获的2种共培养不定根生物量较高。22、(2)本发明通过共培养人参和葛根不定根时，获得人参皂苷和葛根素，其人参总含量达0.64％，其总含量是《中国药典》对人参总皂苷规定值0.45％的1.42倍；葛根素含量为3.6％，其总含量是《中国药典》对葛根素规定值2.4％的1.5倍，同时还可刺激产生单一培养时未检测到的活性物。23、(3)本发明通过激素组合可实现人参和葛根的不定根共培养时快速生长，解决了葛根中酚类物质含量高抑制不定根生长的问题；葛根次级代谢产物淀粉可在不定根生长过程为其提供碳源；同时，共培养可以大幅度提高人参皂苷和葛根素含量，有利于活性物质的积累；另外，人参和葛根两种不定根组合，可作为保健品原料直接使用。24、(4)本发明获得的活性物质是人参和葛根生物合成的天然有效成分，葛根与人参配伍是临床上常用中药药对，两者配伍可用于治疗脾胃气虚、外感病证、热病、消渴、麻疹、中风偏瘫等疾病，中医理论认为葛根味甘，性凉可以克制药性温燥的人参，葛根的发散之力可通过人参固涩之效来抑制，两者相辅相成，又能相反相成，是中药配伍增效减毒的范例，可用于食品、医药等行业，可以满足人们的需求。25、(5)本发明培养方法生产周期短、效率高、可工厂化生产，为生产皂苷和葛根素等生理活性物质提供新方法，以及给葛根和人参的合理开发利用提供新思路，可有效保护野生中草药资源，为传统中草药的现代化发展提供机遇。