秀丽隐杆线虫在构建检测抗生素和金属离子联合

本发明涉及生物，尤其涉及秀丽隐杆线虫在构建检测抗生素和金属离子联合毒性的动物模型中的应用。背景技术：1、抗生素是一种可以抑真菌、细菌、病原体等微生物生长和活动的药物。由于其出色的性能已经被广泛应用于人类各种感染的治疗和预防养殖业中牲畜疾病等领域。经过近百年的发展，科学家已经开发出数万种抗生素的生产与使用方法，为公共卫生安全做出了巨大贡献。然而抗生素长期广泛的使用以及其低生物降解性的特点，人们也发现药物残留的问题。其在畜禽粪便、水产养殖业沉积物和土壤中被频繁检出，对环境产生了巨大的安全隐患。因此，研究抗生素对环境生物的影响具有重要的现实意义。2、其中合成类抗生素-氟喹诺酮类(fqs)药物具有广谱抗菌性、生产效率高等优点已经被世界卫生组织列为至关重要的抗生素类，其已被证实会对线虫的生长发育、斑马鱼心血管健康等产生消极影响。环丙沙星(cip)作为第三代fqs药物常被用于治疗皮肤和呼吸道感染，是一种白色结晶粉末微溶于水易溶于稀盐酸中，因此常制备成盐酸环丙沙星。由于其持续的使用和不完备的管理标准，cip已经在地表水、沉积物尤其是医院废水中检测出毫克/升级别的残留。已有文献表明，cip在水稻、果蝇和浮萍中展现出不同程度毒性，但是关于其对土壤线虫的毒性鲜有报道。3、同时镍作为地壳中含量相对丰富的过渡金属元素广泛存在于土壤、水和空气中。由于其出色的物理化学性质，镍在现代工商业制造领域有着广泛的应用，例如精炼、焊接；尤其是在可循环镍镉电池制造以及电镀行业中。但是在镍矿的开采冶炼、合金制造加工、含镍燃料燃烧排放物和电镀含镍废水的排放会将环境镍浓度不断提高，造成严重的环境问题。尽管镍对植物生长是必须微量元素，但是土壤中镍过量就会造成植物代谢紊乱、发育不良并抑制生长。同时，镍也可以通过皮肤接触和食物摄入进入人体并在人体组织中积累产生毒性效应。4、鉴于cip和镍在日常生产生活中扮演的重要角色，其在环境中共存的概率不容忽视。已有证据表明高浓度的镍离子和环丙沙星已经在医院废水、溪流和河水中检测出。同时在农业灌溉：水-沉积物-土壤-植物系统中也有迹象表明镍和环丙沙星共存的现象。5、目前，尚无文章提出用秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)为研究模型，在生长和生殖方面对镍离子和环丙沙星的联合毒性作用进行评价。技术实现思路1、有鉴于此，本发明提供了秀丽隐杆线虫在构建检测抗生素和金属离子联合毒性的动物模型中的应用。本发明以秀丽隐杆线虫作为模式生物，提供的检测联合毒性动物模型构建方法简单快捷，成本低廉，试验周期短，重复性好，对自然环境下抗生素和金属离子联合毒性及其具体作用方面提供了技术支持，具有实际应用价值。2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：3、本发明提供了秀丽隐杆线虫在构建检测抗生素和金属离子联合毒性的动物模型中的应用。4、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述抗生素包括：环丙沙星；所述金属离子包括：镍离子。5、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述抗生素的浓度为20μm；所述环丙沙星的浓度为300～500μm。6、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述抗生素的浓度为20μm；所述环丙沙星的浓度为300μm或500μm。7、本发明还提供了动物模型的构建方法，包括如下步骤：8、s1：取野生型秀丽隐杆线虫培养，怀卵后，裂解，获得虫卵；9、s2：取所述虫卵培养后，获得l1期线虫；10、s3：取所述l1期线虫暴露于待测样品中，获得所述动物模型；11、所述待测样品含有：抗生素和/或金属离子。12、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述抗生素包括：环丙沙星；所述金属离子包括：镍离子。13、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述抗生素的浓度为20μm；所述环丙沙星的浓度为300～500μm。14、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述抗生素的浓度为20μm；所述环丙沙星的浓度为300μm或500μm。15、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述裂解采用裂解液；所述裂解液包括：氢氧化钠溶液和次氯酸钠溶液；所述氢氧化钠溶液和所述次氯酸钠溶液的体积比为1:(0.1～10)。16、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述氢氧化钠溶液和所述次氯酸钠溶液的体积比为1:4。17、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5～5mol/l。18、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/l。19、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述裂解的时间为18～22h。20、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述暴露的时间为66～72h。21、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述暴露采用培养基；所述培养基包括：k液和大肠杆菌；22、所述k液包括：1～4g/l的kcl和1～4g/l的nacl。23、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述k液包括：2～3g/l的kcl水溶液和/或2～3g/l的nacl水溶液。24、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述大肠杆菌为：尿嘧啶缺陷型大肠杆菌e.coli op50。25、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，当待测样品含有抗生素和金属离子时，为联合暴露组；当待测样品含有抗生素或金属离子时，为单独暴露组；当待测样品不含抗生素和/或金属离子时，为实验对照组。26、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法还包括：检测所述野生型秀丽隐杆线虫的生长指标、运动神经指标、生殖能力指标和性腺发育指标的步骤。27、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述生长指标包括：体长和/或摄食率。28、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，检测所述体长包括如下步骤：l1期秀丽线虫暴露72h后，收集线虫并清洗，将线虫置于60℃下水浴10min，取出线虫转移至固体培养基，用ccd相机通过体视显微镜捕获线虫图片，使用image j对线虫成虫体长进行测定，从线虫头部出发，沿其身体中线画折线，至线虫尾部止，折线总长即为线虫体长；29、所述固体培养基可以为ngm培养基，其具体组成为：400ml去离子水，1.2gnacl，6.8g琼脂，1g蛋白胨，10mlk3po4缓冲溶液(100ml去离子水，10.83gkh2po4，4.66gk2hpo4·3h2o)，0.4ml 1m cacl，0.4ml1m mgso4，0.4ml 5mg/ml胆固醇的乙醇溶液。30、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，检测所述摄食率包括如下步骤：记录未暴露对照组od6001，设置实验对照组，并在20℃培养48h后记录实验对照组od6002，空白对照组od6003、单独暴露组od6004和联合暴露od6005，根据公式食物清除率＝(od6003或od6004或od6005-od6002)÷od6001，得出摄食率。31、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述运动神经指标包括：头部摆动。32、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，检测所述头部摆动包括如下步骤：暴露结束后，将每组线虫转移至仅含1ml k液的24孔板中；稳定静置1分钟后在安装ccd相机的体式显微镜下捕获各组线虫高分辨率视频30秒；记录固定时间段线虫头部摆动的次数；单次头部摆动定义为线虫头部从原有方向摆动至另一侧再回到原来方向。33、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述生殖能力指标包括：怀卵数、卵孵化率、后代数和/或世代时间中的一种或多种。34、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，检测所述怀卵数包括如下步骤：l1期秀丽隐杆线虫暴露72h后，收集部分线虫并清洗，将线虫转移至固体培养基中，使用裂解液裂解怀卵线虫，对每条线虫体内虫卵进行计数。35、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，检测所述卵孵化率包括如下步骤：l1期秀丽隐杆线虫暴露72h后，收集线虫并清洗，将线虫第一个小时产下的卵转移至不含食物的固体培养基中，然后在20℃下孵育24小时。随后对l1幼虫和培养基上剩余的任何未孵化的卵进行计数，通过计算l1幼虫数除以l1幼虫总数和未孵化卵数的比值来确定孵化率。36、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，检测所述后代数包括如下步骤：l1期秀丽隐杆线虫暴露72h后，将秀丽线虫用k液冲洗并转移至固体培养基中，培养基放置线虫待其自然生产后代，将亲代线虫转移到新鲜固体培养板，每天转移成虫至新的培养板，对固体培养基上孵化出的幼虫进行计数，重复上述操作至线虫成虫不再产卵，每条线虫产出的可以成功孵化的幼虫数为后代数。37、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，检测所述世代时间包括如下步骤：l1期秀丽隐杆线虫暴露72h后，记录第产下第一枚卵时间并将其培养至成虫记录其第一次产卵时间，计算二者时间之差即为世代时间。38、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述性腺发育指标包括：生殖细胞凋亡数和/或性腺细胞数量。39、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，检测所述生殖细胞凋亡数包括如下步骤：将暴露后秀丽隐杆线虫收集于离心管中，用k液清洗3次后放于24孔板中，加入k液500μl并添加50倍大肠杆菌溶液5μl，恢复约10h后，在各孔中加入100μl的荧光染色剂暗处染色1h。染色结束收集并清洗线虫2次，转移至琼脂板上恢复40min；取载玻片，在中央滴入10μl的固定液，挑取30条左右线虫入左旋咪唑液滴，待线虫不再运动后用盖玻片盖住液滴，在荧光显微镜下观察线虫单侧性腺臂中的细胞凋亡个数；所述染色剂为150g/ml浓度的吖啶橙；所述固定液为60μg/ml浓度的左旋咪唑溶液。40、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，检测所述性腺细胞数量包括如下步骤：暴露结束后，收集线虫于离心管中，k液洗净弃上清加入无水乙醇清洗三次，以杀死线虫所有细胞；取载玻片，将各组虫液滴于载玻片上，待乙醇自然风干后，在中央滴入10μl染色剂，于暗处染色20min后在荧光显微镜下观察线虫性腺臂内所有细胞数量；所述染色剂优选为碧云天公司出品dapi染色剂。41、在本发明的一些实施方案中，上述构建方法中，所述检测标准为：42、当所述联合暴露组与所述单独暴露组终点指标无差别(p>0.05)时，判定环丙沙星对镍离子毒性效应无影响；43、当所述联合暴露组与所述单独暴露组终点指标有差别(p<0.05)，判定环丙沙星对镍离子毒性效应有影响。44、本发明还提供了上述构建方法获得的动物模型。45、本发明还提供了动物模型在检测抗生素和金属离子联合毒性中的应用。46、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述抗生素包括：环丙沙星；所述金属离子包括：镍离子。47、本发明提供了秀丽隐杆线虫在构建检测抗生素和金属离子联合毒性的动物模型中的应用。48、本发明提供了一种基于秀丽隐杆线虫在检测抗生素环丙沙星和金属镍离子联合毒性中的应用。包括：将同步化后同一时期的秀丽隐杆线虫分别暴露于对照组与实验组培养基中，培养66～72h后，根据线虫体长、摄食率、头部摆动、怀卵数、卵孵化率、后代数、世代时间、生殖细胞凋亡数和性腺细胞数指标评价环丙沙星和镍联合毒性在生长、神经、生殖、性腺发育四个方面的影响；所述对照组培养基包括缓冲液和大肠杆菌；所述实验组培养基包括缓冲液、大肠杆菌、镍或环丙沙星或环丙沙星和镍混合物。本发明以秀丽隐杆线虫作为模式生物，提供的联合毒性检测方法简单快捷，成本低廉，试验周期短，重复性好，对自然环境下抗生素和金属离子联合毒性及其具体作用方面提供了技术支持，具有实际应用价值。