一种细胞冻存液及其在细胞制剂中应用的制作方

本发明涉及生物，特别涉及一种细胞冻存液及其在细胞制剂中的应用。背景技术：1、细胞治疗是指通过植入自体或异体细胞来治疗疾病或改善生理功能的一种治疗方法。与小分子药物、大分子药物及蛋白类药物相比，细胞治疗最大的特点是使用活细胞作为药物，因此在细胞活性的保存方面有更高要求。随着生物技术的迅速发展和对细胞特性的深入了解，细胞治疗迅速发展并广泛应用于临床实践，特别是在自身免疫性疾病、退行性疾病、心血管疾病和肿瘤等领域。2、已应用于临床的细胞治疗药物从细胞药物的保存条件上可以分为新鲜细胞制剂和冻存细胞制剂。其中新鲜细胞制剂是指将培养扩增过程中的细胞通过消化和清洗步骤后，使用生理模拟液和缓冲液进行重悬后，进行临床应用。冻存细胞制剂是指将培养扩增得到的细胞，重悬于冻存液中，而后将其置于低温条件下保存（一般应低于-80℃），使得细胞内的酶活性完全停止，细胞代谢活动停止，实现细胞的长期保存。使用前可以将冻存细胞置于不超过37℃的环境下进行融化复苏，而后进行临床应用。理论上新鲜细胞制剂未经过冻存复苏过程直接使用，具有细胞活率高、细胞功能更优的特点。相应地，新鲜细胞制剂对保存环境的温湿度有极高的要求，而且大多需要特殊的保存液为细胞提供平衡条件及营养体系。即使在这种条件下，细胞的保存时间大多也不会超过72小时。因此新鲜细胞制剂可应用的地理范围及其有限。另一方面，细胞药物放行检验中的无菌检测、支原体检测、病毒检测等项目所需时间较长，为14-180天，远超新鲜细胞制剂的有效期。因此这些检测项目需要在未出结果前进行风险放行，一定程度上增加了患者的风险。3、细胞冻存剂型能够在一定程度上解决这一问题。细胞冻存时使用甘油或二甲基亚砜等冷冻保护剂，这些物质可以提高细胞膜对水的通透性，使细胞内的水在低温下不易形成尖锐的冰晶，从而减少尖锐冰晶对细胞的损伤。细胞在冻存条件下，保存时间可以达到几年甚至几十年，这期间有足够的时间对该冻存体系进行充分的稳定性研究。另外，冻存条件可以通过液氮或干冰进行维持，无需额外的电力输入维持，能够运输至离制备地较远的地方。因此冻存细胞制剂在地理范围上有更大的应用空间。当然，细胞冻存剂型在带来优势的同时也带来一些伴随的问题。首先，冻存液中需要添加渗透性或非渗透性的冷冻保护剂，这些物质往往具有一定的细胞毒性或组织毒性，因此在冻存制剂进行临床应用时，需要对其进行一定程度的稀释或洗涤，以减少冷冻保护剂的毒性。其次，冻存细胞的细胞活性大多低于新鲜细胞，因此需要对冻存液进行详尽的配方研究，以确保其能够维持细胞在冻存方面的活率、凋亡等效果。4、细胞药物从制剂的形态上可以分为细胞悬液和非细胞悬液。细胞悬液即为上述将细胞重悬于生理模拟液或缓冲溶液中。非细胞悬液可以理解为组织工程方法，将细胞与材料结合，或通过一定的培养方式，形成细胞聚集体，而后再对细胞进行应用。举例来说，已通过美国药监局审批的软骨修复技术aci和maci即是使用自体软骨细胞悬液，注射至软骨缺损部位，并通过骨膜或胶原膜对缺损部位进行严密覆盖，防止自体软骨细胞流失，从而实现原位软骨修复。但目前已经可以通过一些组织工程方法如cartione™，将软骨细胞与支架材料结合后，直接移植至软骨缺损部位，这样能够直接避免软骨细胞的流失。目前除了免疫细胞用于肿瘤疾病治疗多通过静脉回输进行给药。干细胞及终末期分化的体细胞在临床应用时多用于自身免疫性疾病、退行性疾病、心血管疾病治疗。部分应用场景更需要细胞停留在局部，更长期地发挥功能和作用。此时与材料结合是一个可能的选择。5、材料的形式将对其功能、性质和应用产生直接影响。现有文献及临床研究中所报道的材料形式有多孔材料、纤维材料、凝胶材料等。其中凝胶材料具有一定的流动性，能够更好地适应不同应用部位的形状，具有良好的应用前景。既有报道中也证实，与凝胶材料结合的细胞药物能够在组织内部留存更长时间，从而发挥更大的功效。技术实现思路1、本公开提供了一种能形成凝胶的细胞冻存液，使用该细胞冻存液对细胞进行冻存时，能够让细胞在低温条件下维持活性保持。该细胞冻存液包含凝血酶，利用纤维蛋白与凝血酶形成凝胶的原理，复苏后细胞悬液直接与纤维蛋白原进行混合，可实现原位成胶，能够得到被凝胶材料包裹的细胞制剂，减少细胞随液体流失造成的损失。同时，该凝胶能够维持细胞在其中的活性，从而实现更好的功效发挥。2、本公开的一方面提供了一种细胞冻存液，包括二甲基亚砜、可溶性钙盐和凝血酶。3、本公开中，将无细胞及组织毒性的凝血酶作为非渗透性冷冻保护剂加入细胞冻存液中，降低具有细胞和组织毒性的二甲基亚砜浓度。同时，所述细胞冻存液不通过清洗的方式去除dmso，提高了细胞冻存制剂使用的便捷性。4、在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，所述二甲基亚砜的浓度为0.01% (v/v)-10% (v/v)，例如可以为0.01% (v/v)、0.05% (v/v)、0.1 (v/v)、0.5 (v/v)、1 (v/v)、2 (v/v)、4 (v/v)、6 (v/v)、8 (v/v)、10 (v/v)或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述细胞冻存液中，所述二甲基亚砜的浓度为0.01% (v/v)-5% (v/v)，更优选为0.01% (v/v)-3% (v/v)。5、在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，所述凝血酶的浓度为1-100 iu/ml，例如可以为1 iu/ml、2 iu/ml、5 iu/ml、10 iu/ml、20 iu/ml、30 iu/ml、40 iu/ml、50 iu/ml、60iu/ml、70 iu/ml、80 iu/ml、90 iu/ml、100 iu/ml或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述细胞冻存液中，所述凝血酶的浓度为2-50 iu/ml，更优选为5-25 iu/ml。6、在一些实施方式中，所述细胞冻存液中，所述可溶性钙盐的浓度为1-60 mm，例如可以为1 mm、5 mm、10 mm、15 mm、20 mm、30 mm、40 mm、50 mm、60 mm或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述细胞冻存液中，所述可溶性钙盐的浓度为1-20 mm。7、在一些实施方式中，所述凝血酶的来源可以为人纤维蛋白原，也可以为其他动物种属的凝血酶，如牛凝血酶、兔凝血酶、鼠凝血酶、羊凝血酶、猪凝血酶及其他种属来源凝血酶，也可以是两种或两种以上凝血酶的混合物。8、在一些实施方式中，所述可溶性钙盐包括氯化钙、溴化钙、硝酸钙、氯酸钙、高氯酸钙、碳酸氢钙、磷酸二氢钙中的一种或多种。优选地，所述可溶性钙盐为氯化钙。9、在一些实施方式中，所述细胞冻存液还包括渗透性冻存保护剂、非渗透性冻存保护剂、缓冲溶液和生理溶液中的至少一种。10、在一些实施方式中，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲溶液、hepes缓冲溶液或hank’s缓冲溶液。11、在一些实施方式中，所述生理溶液包括生理盐水或葡萄糖注射液。12、在一些实施方式中，所述渗透性冻存保护剂包括丙二醇或乙醇。13、在一些实施方式中，所述非渗透性冻存保护剂包括白蛋白、海藻糖、葡聚糖、聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖、羟乙基淀粉。14、在一些实施方式中，所述细胞冻存液包括二甲基亚砜、氯化钙、凝血酶、葡萄糖、右旋糖酐、甘油和白蛋白。15、在一些实施方式中，所述细胞冻存液包括0.01-10% (v/v)二甲基亚砜、1-60mmol/l氯化钙、1-100 iu/ml凝血酶、0.01-0.5 mmol/l葡萄糖、1-10% (w/v) 右旋糖酐、0.01-5% (v/v) 丙二醇和1-10% (w/v) 白蛋白。16、在一些实施方式中，所述细胞冻存液包括0.01-3% (v/v)二甲基亚砜、1-20 mmol/l氯化钙、2-50 iu/ml凝血酶、0.1-0.3 mmol/l葡萄糖、2-8% (w/v) 右旋糖酐、0.5-2% (v/v) 丙二醇和2-8% (w/v) 白蛋白。17、在一些实施方式中，所述细胞冻存液还包括磷酸盐缓冲溶液。在一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液包括120-180（例如120、140、160、180）mmol/l氯化钠、0.5-5（例如0.5、1、1.5、2、2.5、2.68、3、3.5、4、4.5、5）mmol/l氯化钾、0.5-5（例如0.5、1、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5）mmol/l磷酸二氢钾和1-20（例如1、5、10、15、20）mmol/l磷酸氢二钠。在一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液还包括0.05-5（例如0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5）mmol/l镁离子。18、本公开的另一方面提供了所述的细胞冻存液在冷冻保存细胞或在形成凝胶材料中的应用。19、在一些实施方式中，所述细胞冻存液中的细胞密度为1×107/ml~5×107/ml，例如为1×107/ml、2×107/ml、3×107/ml、4×107/ml、5×107/ml或它们之间的任意值。优选地，所述细胞冻存液中的细胞密度为1×107/ml~3×107/ml。20、在一些实施方式中，所述凝胶材料包裹有细胞。21、在一些实施方式中，所述细胞包括干细胞。22、在一些实施方式中，所述细胞包括间充质干细胞。23、在一些实施方式中，所述细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞。24、本公开的又一方面提供了一种用于形成凝胶的组合物，所述组合物包括所述的细胞冻存液和纤维蛋白原溶液。25、在一些实施方式中，所述纤维蛋白原溶液包括纤维蛋白原和溶剂。26、在一些实施方式中，所述纤维蛋白原溶液中，所述纤维蛋白原的浓度为5-100 mg/ml，例如为5 mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml、60 mg/ml、70 mg/ml、80 mg/ml、90 mg/ml、100 mg/ml或它们之间的任意值。优选地，所述纤维蛋白原溶液中，所述纤维蛋白原的浓度为10-75 mg/ml，更优选为30-60 mg/ml。27、在一些实施方式中，所述细胞冻存液与所述纤维蛋白原溶液的混合体积比为1：（0.5-2），例如为1:0.5、1:0.75、1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75、1:2或它们之间的任意值。优选地，所述细胞冻存液与所述纤维蛋白原溶液的混合体积比为1：（0.8-1.2）。28、在一些实施方式中，所述溶剂包括生理盐水、注射用水或磷酸盐缓冲溶液。29、在一些实施方式中，所述纤维蛋白原的来源可以为人纤维蛋白原，也可以为其他动物种属的纤维蛋白原，如牛纤维蛋白原、兔纤维蛋白原、鼠纤维蛋白原、羊纤维蛋白原、猪纤维蛋白原及其他种属来源纤维蛋白原，也可以是两种或两种以上纤维蛋白原的混合物。30、在一些实施方式中，所述纤维蛋白原和所述凝血酶的种属可以相同也可以不同。31、本公开的又一方面提供了一种细胞制剂，通过所述的组合物制备得到。32、在一些实施方式中，所述细胞制剂为凝胶形式。33、在一些实施方式中，所述细胞制剂中的细胞被凝胶包裹。优选地，所述细胞制剂中的90%以上的细胞被凝胶包裹。34、在一些实施方式中，所述细胞包括干细胞。35、在一些实施方式中，所述细胞包括间充质干细胞。36、在一些实施方式中，所述细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞。37、本公开的又一方面提供了所述细胞制剂的制备方法，包括将冻存有细胞的所述细胞冻存液融化后与所述纤维蛋白原溶液混合，形成凝胶。38、在一些实施方式中，所述细胞冻存液与所述纤维蛋白原溶液的混合体积比为1：（0.5-2），例如为1:0.5、1:0.75、1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75、1:2或它们之间的任意值。优选地，所述细胞冻存液与所述纤维蛋白原溶液的混合体积比为1：（0.8-1.2）。39、在一些实施方式中，本公开还提供了所述细胞冻存液、所述组合物、所述细胞制剂或所述制备方法获得的细胞制剂在制备用于细胞治疗药物中的应用。40、在一些实施方式中，所述细胞治疗药物用于治疗自身免疫性疾病、退行性疾病、心血管疾病、肿瘤。41、本发明的技术方案具有如下的有益效果：42、1. 本发明中的细胞冻存液能够为细胞提供大于6个月的低温保存。43、2. 本发明中细胞冻存液冻存的细胞复苏后可与纤维蛋白原溶液形成稳定的凝胶结构。44、3. 本发明中细胞冻存液冻存的细胞复苏后可与纤维蛋白原溶液形成稳定的凝胶结构，所形成的凝胶中细胞仍能够保持活性。45、4. 本发明中细胞冻存液冻存的细胞复苏后可与纤维蛋白原溶液形成稳定的凝胶结构，该凝胶结构能够将绝大部分细胞（>90%）进行包裹。46、5. 本发明中细胞冻存液冻存的细胞复苏后可与纤维蛋白原溶液形成稳定的凝胶结构。细胞冻存、细胞复苏及凝胶结构形成过程不会造成细胞的大量死亡，也不会造成细胞大量凋亡。47、6. 本发明中细胞冻存液冻存的细胞复苏后可与纤维蛋白原溶液形成稳定的凝胶结构，细胞在该凝胶中能够稳定存活。