一种石蜡油覆盖后能有效提高人精子冷冻复苏率

本发明属于辅助生殖，具体地说，涉及一种石蜡油覆盖后能有效提高人精子冷冻复苏率的精液冷冻方法。背景技术：1、精液冷冻的原理是通过冷冻保护剂渗透进入细胞,细胞脱水，减少胞内冰晶,降低对精子的损伤,实现精子冷冻保存。2、冷冻精子方法是一种辅助生育的手段，通过将男性的健康精子放置在加入保护剂的超低温环境，促使精子进行冷冻，在有生育需求时将精子进行解冻，通过辅助生殖手段，进行成功生育。临床上，该方法常会用于需要进行辅助生殖治疗的患者、梗阻性无精子症患者、少精症及弱精症患者等，通过冷冻精子能够降低未来生育风险，提高生育几率。3、目前临床上常规使用的精液冷冻方法为快速冷冻法：(1)将精液样本与保护剂充分混匀加入冻存管(2)将冻存管放置液氮上方3-4cm处悬吊12min(3)投入到液氮中(4)放入37℃水浴锅10min复苏，但是在解冻后发现，平均精子的冷冻复苏50％-60％左右(精液质量影响冷冻复苏率，一般来说精液质量越高复苏率也越高)。自19世纪50年代开始使用10％甘油作为冷冻保护剂以来，生物冷冻领域再也没有研究出能够进一步有效提高精子冷冻复苏率的方法。4、有鉴于此特提出本发明。技术实现思路1、为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：2、一种石蜡油覆盖后能有效提高人精子冷冻复苏率的精液冷冻方法，包括以下操作步骤：3、步骤一：选取精液样本，将精液样本与保护剂充分混匀；4、步骤二：将1ml精液加入冻存管，在精液上层覆盖200ul石蜡油；5、步骤三：将冻存管放置液氮上方处悬吊；6、步骤四：将冻存管放入液氮内；7、步骤五：30min后将冻存管取出放入水浴锅内复苏。8、作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一中，保护剂与精液样本的混合比例为1:3，所述保护剂由甘油、甘油-蛋黄-枸橼酸钠等组成。保护剂具有高的水溶性，可与水以任何比例混合，确保在冰晶形成初期，稀释细胞外液中溶质的浓度。在冷冻过程中，渗透性保护剂渗入细胞内，替代水分延缓了细胞内水分的减少及由此引起的溶质浓度增加，减轻细胞皱缩的程度，保护细胞顺利通过冰晶形成阶段。9、作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤三中，悬吊后的冻存管距离液氮表面有3-4cm的距离，并且需要悬吊12min。10、作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤五中，水浴锅的稳定控制在37℃，并且复苏时间控制在10min，对复苏完毕的精液通过精子质量分析仪分析精液的活性。解冻要严格控制解冻时间，不能超过一定的时间，否则因过热影响精子活力，造成精子在复苏过程中的大量死亡。11、作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤一中的精液样本，通过检查筛选，且检查筛选的方式包括观察精液量、精液颜色、精子液化情况以及精子活动度等。12、本发明与现有技术相比具有以下有益效果：13、本发明，在辅助生殖技术中石蜡油通常用于覆盖培养液，石蜡油不容于水对细胞无毒无害，能够有效防止培养液蒸发，保持培养液ph、温度和湿度的稳定性；石蜡油导热迅速，能够帮助精液快速降温，减少精子处于冰晶生成的危险温度区域，从而降低精子冷冻损伤。本发明是在冷冻精液标本时，将石蜡油覆盖于精液表面，可以使精液与外部环境隔离，与传统快速冷冻法相比，此种冷冻方法降温曲线更加迅速且平稳，冷冻效果更稳定，冷冻后复苏率显著提高。14、下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。技术特征：1.一种石蜡油覆盖后能有效提高人精子冷冻复苏率的精液冷冻方法，其特征在于，包括以下操作步骤：2.根据权利要求1所述的一种石蜡油覆盖后能有效提高人精子冷冻复苏率的精液冷冻方法，其特征在于，所述步骤一中，保护剂与精液样本的混合比例为1:3，所述保护剂由甘油、甘油-蛋黄-枸橼酸钠等组成。3.根据权利要求1所述的一种石蜡油覆盖后能有效提高人精子冷冻复苏率的精液冷冻方法，其特征在于，所述步骤五中，水浴锅的稳定控制在37℃，并且复苏时间控制在10min，对复苏完毕的精液通过精子质量分析仪分析精液的活性。4.根据权利要求1所述的一种石蜡油覆盖后能有效提高人精子冷冻复苏率的精液冷冻方法，其特征在于，所述步骤一中的精液样本，通过检查筛选，且检查筛选的方式包括观察精液量、精液颜色、精子液化情况以及精子活动度等。技术总结本发明涉及辅助生殖技术领域，公开了一种石蜡油覆盖后能有效提高人精子冷冻复苏率的精液冷冻方法，其特征在于，包括以下操作步骤：选取精液样本，与保护剂充分混匀；将精液加入冻存管，在精液上层覆盖200ul石蜡油；将冻存管放置液氮上方3‑4cm处悬吊12min；将冻存管放入液氮内；将冻存管取出放入水浴锅内复苏。本发明，石蜡油能够有效防止培养液蒸发，保持培养液ph、温度和湿度的稳定性；石蜡油导热迅速，能够帮助精液快速降温，减少精子处于冰晶生成的危险温度区域，从而降低精子冷冻损伤。本发明是在冷冻精液标本时，石蜡油可以使精液与外部环境隔离，与传统快速冷冻法相比，此种冷冻方法降温曲线更加迅速且平稳，冷冻后复苏率显著提高。技术研发人员：孟天庆,李丹,张行杰,蔡明,袁周,熊承良受保护的技术使用者：武汉华科生殖专科医院技术研发日：技术公布日：2024/3/31