一种山药的病毒脱毒方法与流程

本发明属植物脱毒，具体涉及一种山药的病毒脱毒方法。背景技术：1、山药(dioscorea oppositifolia l.)为薯蓣科薯蓣属植物，其肉质块茎富含淀粉、蛋白质、氨基酸、维生素等营养成分,具有健脾、补肺、益肾等功效,兼具食用价值与保健功能，应用前景广阔。安顺山药作为贵州省安顺地区的特色经济作物，安顺山药的含水量、蛋白质和总氨基酸含量明显高于国内其他省市生产的山药，具有较高的食用价值和药用价值。生产中通常使用山药块茎进行无性繁殖，这就使得病毒容易在世代中积累，并加剧病毒病的发生，严重影响产量和质量。目前国内外已报道的山药病毒有17种，其中我国报道的病毒主要有马铃薯y病毒(potato virus y，pvy)、马铃薯卷叶病毒(potato leaffoll rolerovirs，plrv)、马铃薯a病毒(potato virus a，pva)、马铃薯s病毒(potato virus s，pvs)、马铃薯x病毒(potato virus x，pvx)、马铃薯m病毒(potato virus m，pvm)、淮山药温和花叶病毒(yammild mosaic virus，ymmv)、日本淮山药花叶病毒(japanese yam mosaic virus，jymv)等11种。生化药剂的施用并不能从源头上切断病毒的积累传播，病毒病在山药各主产区时有发生。2、利用脱毒技术生产高质量种苗是农业生产提质增效的重要手段，此技术已在百合、草莓、半夏、马铃薯等多种无性繁殖作物的生产中获得良好成效。前人研究表明，茎尖培养可有效脱除南城淮山中jymv、pvy和马铃薯纺锤块茎类病毒，运用此技术获得的脱毒山药可增产38％。目前，山药脱毒技术的相关研究较少，常用脱毒方法单一导致脱毒效率不高，研究脱毒方法组合效益提高山药脱毒效率十分有必要。3、为提高山药脱毒效率，本研究以安顺山药为供试材料，在调查安顺地区病毒种类分布的基础上，结合茎尖培养、热处理和化学药剂处理多种方法，探索山药最适脱毒策略，以期为山药脱毒生产提供借鉴。技术实现思路1、本发明的目的在于，提供一种山药的病毒脱毒方法。本发明通过通过对山药茎尖剥离后，采用热处理和利巴韦林脱毒，能有效免除日本淮山药花叶病毒(jymv)、马铃薯y病毒(pvy)、马铃薯x病毒(pvx)和马铃薯卷叶病毒(plrv)的侵害。2、本发明的技术方案：一种山药的病毒脱毒方法，所述方法是通过对山药茎尖剥离后，采用热处理和利巴韦林脱毒，有效去除日本淮山药花叶病毒、马铃薯y病毒、马铃薯x病毒和马铃薯卷叶病毒的方法。3、前述的山药的病毒脱毒方法，所述方法包括以下步骤：4、(1)热处理：取山药盆栽放置于人工气候箱中培养，在1500-2500lux光照条件下，40-50℃热处理8-24h，得到热处理后的山药，备用；5、(2)茎尖剥离：取热处理后的山药健康粗壮茎尖，流水冲洗，先用75％乙醇消毒，75％乙醇用量为浸没外植体即可，再用0.1％升汞消毒，0.1％升汞用量为浸没外植体即可，用无菌水清洗后，于超净台解剖镜下茎尖剥至0.1-0.7mm，得到剥离好的山药茎尖，备用；6、(3)利巴韦林母液制备：取利巴韦林溶于蒸馏水中，摇匀后使用0.22μm无菌滤膜过滤灭菌，得到利巴韦林母液，备用；7、(4)利巴韦林培养基制备：取ms+琼脂5-7g/l+蔗糖25-35g/l作为基础培养基，基础培养基ph为5.4-6.0，经高压灭菌锅115-125℃灭菌15-25min后，冷却至35-65℃时加入利巴韦林母液混匀，利巴韦林母液浓度为30-70mg/l，分装冷凝，得到利巴韦林培养基，备用；8、(5)脱毒：将剥离好的山药茎尖放置于利巴韦林培养基中培养2-3个月，待植株生长至2～3片叶时，即可。9、前述步骤(1)中，热处理：取山药盆栽放置于人工气候箱中培养，在2000lux光照条件下，40℃热处理8h，得到热处理后的山药，备用。10、前述步骤(2)中，茎尖剥离：取热处理后的山药健康粗壮茎尖，流水冲洗25-35min，先用75％乙醇消毒15-25s，75％乙醇用量为浸没外植体即可，再用0.1％升汞消毒5-10min，0.1％升汞用量为浸没外植体即可，用无菌水清洗3-5次后，于超净台解剖镜下茎尖剥至0.3-0.5mm，得到剥离好的山药茎尖，备用。11、具体的说，前述步骤(2)中，茎尖剥离：取热处理后的山药健康粗壮茎尖，流水冲洗30min，先用75％乙醇消毒20s，75％乙醇用量为浸没外植体即可，再用0.1％升汞消毒8min，0.1％升汞用量为浸没外植体即可，用无菌水清洗4次后，于超净台解剖镜下茎尖剥至0.3-0.5mm，得到剥离好的山药茎尖，备用。12、前述步骤(3)中，利巴韦林母液制备：取7.0g利巴韦林溶于蒸馏水中并定容至10ml，摇匀后使用0.22μm无菌滤膜过滤灭菌，得到利巴韦林母液，备用；13、前述步骤(4)中，利巴韦林培养基制备：取ms+琼脂6g/l+蔗糖30g/l作为基础培养基，基础培养基ph为5.6-5.8，经高压灭菌锅121℃灭菌20min后，冷却至40-60℃时加入利巴韦林母液混匀，利巴韦林母液浓度为50mg/l，分装冷凝，得到利巴韦林培养基，备用。14、前述步骤(5)中，培养条件为20-25℃，光照1500-2500lux，光照时间为10-14h/天。15、具体的说，前述步骤(5)中，培养条件为21-23℃，光照2000lux，光照时间为12h/天。16、本发明与现有技术比较，具有以下优点：17、按照本发明对山药的脱毒方法进行脱毒，能有效免除日本淮山药花叶病毒(jymv)、马铃薯y病毒(pvy)、马铃薯x病毒(pvx)和马铃薯卷叶病毒(plrv)的侵害。使得山药的成活率达到85％以上。技术特征：1.一种山药的病毒脱毒方法，其特征在于：所述方法是通过对山药茎尖剥离后，采用热处理和利巴韦林脱毒，有效去除日本淮山药花叶病毒、马铃薯y病毒、马铃薯x病毒和马铃薯卷叶病毒的方法。2.根据权利要求1所述的山药的病毒脱毒方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：3.根据权利要求2所述的山药的病毒脱毒方法，其特征在于：所述步骤(1)中，热处理：取山药盆栽放置于人工气候箱中培养，在2000lux光照条件下，40℃热处理8h，得到热处理后的山药，备用。4.根据权利要求2所述的山药的病毒脱毒方法，其特征在于：所述步骤(2)中，茎尖剥离：取热处理后的山药健康粗壮茎尖，流水冲洗25-35min，先用75％乙醇消毒15-25s，75％乙醇用量为浸没外植体即可，再用0.1％升汞消毒5-10min，0.1％升汞用量为浸没外植体即可，用无菌水清洗3-5次后，于超净台解剖镜下茎尖剥至0.3-0.5mm，得到剥离好的山药茎尖，备用。5.根据权利要求4所述的山药的病毒脱毒方法，其特征在于：所述步骤(2)中，茎尖剥离：取热处理后的山药健康粗壮茎尖，流水冲洗30min，先用75％乙醇消毒20s，75％乙醇用量为浸没外植体即可，再用0.1％升汞消毒8min，0.1％升汞用量为浸没外植体即可，用无菌水清洗4次后，于超净台解剖镜下茎尖剥至0.3-0.5mm，得到剥离好的山药茎尖，备用。6.根据权利要求4所述的山药的病毒脱毒方法，其特征在于：所述步骤(3)中，利巴韦林母液制备：取7.0g利巴韦林溶于蒸馏水中并定容至10ml，摇匀后使用0.22μm无菌滤膜过滤灭菌，得到利巴韦林母液，备用。7.根据权利要求2所述的山药的病毒脱毒方法，其特征在于：所述步骤(4)中，利巴韦林培养基制备：取ms+琼脂6g/l+蔗糖30g/l作为基础培养基，基础培养基ph为5.6-5.8，经高压灭菌锅121℃灭菌20min后，冷却至40-60℃时加入利巴韦林母液混匀，利巴韦林母液浓度为50mg/l，分装冷凝，得到利巴韦林培养基，备用。8.根据权利要求2所述的山药的病毒脱毒方法，其特征在于：所述步骤(5)中，培养条件为20-25℃，光照1500-2500lux，光照时间为10-14h/天。9.根据权利要求8所述的山药的病毒脱毒方法，其特征在于：所述步骤(5)中，培养条件为21-23℃，光照2000lux，光照时间为12h/天。技术总结本发明提供一种山药的病毒脱毒方法。本发明通过通过对山药茎尖剥离后，采用热处理和利巴韦林脱毒，能有效免除日本淮山药花叶病毒(JYMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)的侵害。病毒最佳脱除方法为茎尖剥至0.3‑0.5mm、40℃热处理8h、利巴韦林50mg/L。技术研发人员：邓禄军,阳腾,刘怒安,夏锦慧受保护的技术使用者：贵州省生物技术研究所（贵州省生物技术重点实验室、贵州省马铃薯研究所、贵州省食品加工研究所）技术研发日：技术公布日：2024/3/31