用于增强根系发育的方法和组合物与流程

本发明涉及通过修饰内源性丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因，例如内源性磷饥饿耐受性1(phosphorous starvation tolerance 1，pstol1)核酸来修饰植物中的根系结构的组合物和方法。本发明进一步涉及使用本发明的方法和组合物生产的植物。背景技术：1、根及其维管系统的发育在泥盆纪早期植物的进化中是重要的(boyce,c.k.theevolutionary history of roots and leaves.in:holbrook nm,zwieniecki ma(编),vascular transport in plants:479-499.elsevier,amsterdam)。作为固着的生物，植物已经调整了它们的根系以获得最佳的营养和水分。2、作物和园艺植物的产量受到许多因素的限制，包括它们吸收水分和营养的能力。因此，提高产量的一种策略是培育具有改良根系结构的植物，人工选择利用了自然选择产生的变异来改良根系结构。3、本发明通过提供用于改变根系结构和改善产量性状的改进的方法和组合物来克服本领域的缺点。技术实现思路1、本发明的一个方面提供了一种植物或其植物部分，其包含在所述植物或其部分的根中表达的内源性ser-thr蛋白激酶基因中的至少一个非天然突变，其中包含所述至少一个非天然突变的内源性ser-thr蛋白激酶基因编码ser-thr激酶，任选地所述ser-thr激酶具有增加的稳定性。2、本发明的另一方面提供了一种包括编辑系统的植物细胞，所述编辑系统包含：(a)crispr-cas效应蛋白；(b)胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶；和(c)具有与内源性磷饥饿耐受性1(pstol1)基因有互补性的间隔区序列的引导核酸。3、本发明的又一方面提供了一种植物细胞，其中包含内源性磷饥饿耐受性1(pstol1)基因中的至少一个非天然突变，其中所述至少一个非天然突变在所述内源性pstol1基因的编码pstol1多肽的pest(p-脯氨酸、e-谷氨酰胺、s-丝氨酸、t-苏氨酸)基序的区域中，所述至少一个非天然突变防止或减少由包含所述至少一个非天然突变的内源性pstol1基因产生的pstol1多肽的泛素化和降解(与由缺乏所述至少一个非天然突变的pstol1基因产生的pstol1多肽相比)，其中所述至少一个非天然突变是使用编辑系统引入的插入或缺失，所述编辑系统包括与所述pstol1基因中的靶位点结合的核酸结合结构域，其中所述pstol1基因：(a)包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no:73的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的编码序列；(c)包含与seq id no:72的位于从约核苷酸3106至约核苷酸3234或从约核苷酸3125至约核苷酸3214的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或与位于seq id no:73的从约核苷酸935至约核苷酸1024的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地与seq id no:75或seq id no:76的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(d)编码与seq id no:74的氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽序列；和/或(e)编码具有与seq id no:74的位于从约残基316至残基344的区域具有至少80％同一性的连续氨基酸区域的氨基酸序列，任选地编码具有与seq id no:77的氨基酸序列具有80％同一性的区域的氨基酸序列。4、本发明的又一方面提供了一种提供具有增强的根系结构的多个植物的方法，所述方法包括在生长区域中种植两个或更多个本发明的植物，从而提供与不包含所述至少一个非天然突变的多个对照植物相比具有增强的根系结构的多个植株，任选地，其中所述具有增强的根系结构的多个植物在胁迫条件下表现出改进的产量性状和/或保留的产量性状，任选地，与没有所述突变和增强的根系结构的植物相比，所述具有增强的根系结构的多个植物包括以下表型中的至少一种：改进的产量特性，在胁迫条件(非生物和/或生物胁迫条件)下维持/保留的产量性状，更陡的根角(例如主根的更陡的根角，和/或侧根和/或次生根的更陡的根角)，增加的分枝数量、增加的通气组织、增加的根生物量和/或更长的根(更长的主根、更多的侧根)。5、本发明还提供了一种生产/育种无转基因的基因组被编辑的植物的方法，包括：(a)使本发明的植物与无转基因的植物杂交，从而将所述突变引入所述无转基因的植物中；和(b)选择包含所述突变但不含转基因的后代植物，从而产生不含转基因的基因组被编辑的植物。6、本发明的另一方面提供了一种编辑植物细胞基因组中的特定位点的方法，所述方法包括以位点特异性方式切割所述植物细胞中内源性磷饥饿耐受性1(pstol1)基因内的靶位点，其中所述内源性pstol1基因：(a)包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no:73的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的编码序列；(c)包含与seq id no:72的位于从约核苷酸3106至约核苷酸3234或从约核苷酸3125至约核苷酸3214的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或与位于seqid no:73的从约核苷酸935至约核苷酸1024的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地与seq id no:75或seq id no:76的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(d)编码与seq id no:74的氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽序列；和/或(e)编码具有与seq id no:74的位于从约残基316至残基344的区域具有至少80％同一性的连续氨基酸区域的氨基酸序列，任选地编码具有与seq id no:77的氨基酸序列具有80％同一性的区域的氨基酸序列，由此在所述植物细胞的内源性pstol1基因内产生编辑。7、本发明的又一方面提供了一种用于制造植物的方法，包括：(a)使包含编码磷饥饿耐受性1(pstol1)多肽的内源性基因的植物细胞群与靶向所述内源性基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶连接了与所述内源性基因中的靶位点结合的核酸结合结构域，所述内源性基因：(i)包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(ii)包含与seq id no:73的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的编码序列；(iii)包含与seq idno:72的位于从约核苷酸3106至约核苷酸3234或从约核苷酸3125至约核苷酸3214的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或与seq id no:73的位于从约核苷酸935至约核苷酸1024的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地与seq id no:75或seq id no:76的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(iv)编码与seq id no:74的氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽序列；和/或(v)编码具有与seq id no:74的位于从约残基316至残基344的区域具有至少80％同一性的连续氨基酸区域的氨基酸序列，任选地编码具有与seq id no:77的氨基酸序列具有80％同一性的区域的氨基酸序列；(b)从群体中选择在编码pstol1多肽的所述内源性基因中包含突变的植物细胞，其中所述突变是框内插入或框内缺失，其中该突变减少或消除pstol1多肽的泛素化；和(c)将选择的植物细胞生长成在编码pstol1多肽的所述内源性基因中包含所述突变的植物。8、在又一方面，本发明提供了一种用于修饰/增强/改善植物的根系结构的方法，所述方法包括：(a)将包含编码磷饥饿耐受性1(pstol1)多肽的内源性基因的植物细胞与靶向所述内源性基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶连接到结合所述内源性基因中的靶位点的核酸结合结构域，所述内源性基因：(i)包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(ii)包含与seq id no:73的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的编码序列；(iii)包含与seq id no:72的位于从约核苷酸3106至约核苷酸3234或从约核苷酸3125至约核苷酸3214的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或与位于seq id no:73的从约核苷酸935至约核苷酸1024的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地与seq id no:75或seq id no:76的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(iv)编码与seq id no:74的氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽序列；和/或(v)编码具有与seq id no:74的位于从约残基316至残基344的区域具有至少80％同一性的连续氨基酸区域的氨基酸序列，任选地编码具有与seq id no:77的氨基酸序列具有80％同一性的区域的氨基酸序列；和(b)将所述植物细胞生长成植物，从而修饰/增强/改善所述植物的根系结构。9、在另一方面，本发明提供了一种生产包含在内源性磷饥饿耐受性1(pstol1)基因中具有突变的至少一个细胞的植物或其部分的方法，所述方法包括使所述植物或植物部分中的内源性pstol1基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸酶的核酸结合结构域结合pstol1基因中的靶位点，其中所述pstol1基因：(a)包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no:73的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的编码序列；(c)包含与seq id no:72的位于从约核苷酸3106至约核苷酸3234或从约核苷酸3125至约核苷酸3214的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或与seq id no:73的位于从约核苷酸935至约核苷酸1024的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地与seq id no:75或seq id no:76的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(d)编码与seqid no:74的氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽序列；和/或(e)编码具有与seq id no:74的位于从约残基316至残基344的区域具有至少80％同一性的连续氨基酸区域的氨基酸序列，任选地编码具有与seq id no:77的氨基酸序列具有80％同一性的区域的氨基酸序列，由此生产包含在所述内源性pstol1基因中具有突变的至少一个细胞的植物或其部分。10、在另一方面，本发明提供了一种生产在编码pstol1多肽的内源性磷饥饿耐受性1(pstol1)基因中具有导致所编码的pstol1多肽的泛素化降低的突变的植物或其部分的方法，所述方法包括使所述植物或植物部分中的内源性基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸酶的核酸结合结构域与所述内源性pstol1基因中的靶位点结合，其中所述内源性pstol1基因：(a)包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no:73的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的编码序列；(c)包含与seq id no:72的位于从约核苷酸3106至约核苷酸3234或从约核苷酸3125至约核苷酸3214的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或与seq id no:73的位于从约核苷酸935至约核苷酸1024的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地与seq id no:75或seq id no:76的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(d)编码与seq id no:74的氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽序列；和/或(e)编码具有与seq id no:74的位于从约残基316至残基344的区域具有至少80％同一性的连续氨基酸区域的氨基酸序列，任选地编码具有与seq id no:77的氨基酸序列具有80％同一性的区域的氨基酸序列，从而产生在编码pstol1多肽的内源性pstol1基因中具有导致所编码的pstol1多肽的泛素化降低的突变的植物或其部分。11、本发明的另一方面提供了一种引导核酸，其结合编码磷饥饿耐受性1(pstol1)多肽的内源性基因中的靶位点，所述内源性基因：(a)包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no:73的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的编码序列；(c)包含与seq id no:72的位于从约核苷酸3106至约核苷酸3234或从约核苷酸3125至约核苷酸3214的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或与seq id no:73的位于从约核苷酸935至约核苷酸1024的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地与seq id no:75或seq id no:76的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(d)编码与seq id no:74的氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽序列；和/或(e)编码具有与seq id no:74的位于从约残基316至残基344的区域具有至少80％同一性的连续氨基酸区域的氨基酸序列，任选地编码具有与seq id no:77的氨基酸序列具有80％同一性的区域的氨基酸序列。12、本发明的又一方面提供了一种系统，其包含本发明的引导核酸和与所述引导核酸缔合的crispr-cas效应蛋白。13、本发明的又一方面提供了一种基因编辑系统，其包含与引导核酸缔合的crispr-cas效应蛋白，其中所述引导核酸包含与磷饥饿耐受性1(pstol1)基因互补和结合的间隔区序列。14、本发明的又一方面提供了一种复合物，其包含含有切割结构域的crispr-cas效应蛋白以及引导核酸，其中所述引导核酸结合磷饥饿耐受性1(pstol1)基因中的靶位点，所述pstol1基因：(a)包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与seq id no:73的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的编码序列；(c)包含与seqid no:72的位于从约核苷酸3106至约核苷酸3234或从约核苷酸3125至约核苷酸3214的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或与seq id no:73的位于从约核苷酸935至约核苷酸1024的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地与seq id no:75或seq id no:76的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(d)编码与seq id no:74的氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽序列；和/或(e)编码具有与seq id no:74的位于从约残基316至残基344的区域具有至少80％同一性的连续氨基酸区域的氨基酸序列，任选地编码具有与seq id no:77的氨基酸序列具有80％同一性的区域的氨基酸序列，其中所述切割结构域切割所述pstol1基因中的靶链。15、本发明的另一方面提供了一种表达盒，其包含：(a)编码包含切割结构域的crispr-cas效应蛋白的多核苷酸和(b)与磷饥饿耐受性1(pstol1)基因中的靶位点结合的引导核酸，其中所述引导核酸包含与pstol1基因中的所述靶位点互补并结合的间隔区序列，其中所述pstol1基因：(i)包含与seq id no:72的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(ii)包含与seq id no:73的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的编码序列；(iii)包含与seq id no:72的位于从约核苷酸3106至约核苷酸3234或从约核苷酸3125至约核苷酸3214的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，或与seq id no:73的位于从约核苷酸935至约核苷酸1024的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地与seq id no:75或seq id no:76的连续核苷酸区域具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(iv)编码与seq id no:74的氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽序列；和/或(v)编码具有与seq id no:74的位于从约残基316至残基344的区域具有至少80％同一性的连续氨基酸区域的氨基酸序列，任选地编码具有与seq id no:77的氨基酸序列具有80％同一性的区域的氨基酸序列。16、在另一方面，本发明提供了一种编码磷饥饿耐受性1(pstol1)多肽的突变核酸，所述突变核酸编码具有突变的泛素化位点，并且所述突变破坏由所述突变的核酸编码的pstol1多肽的泛素化，任选地，其中所述泛素化位点是pest(p-脯氨酸、e-谷氨酰胺、s-丝氨酸、t-苏氨酸)基序。17、还提供了在其基因组中包含通过本发明的方法产生的具有非天然突变的一个或多个磷饥饿耐受性1(pstol1)基因的植物以及用于制造本发明的植物的多肽、多核苷酸、核酸构建体、表达盒和载体。18、在下面的本发明描述中更详细地阐述了本发明的这些和其他方面。19、序列的简要描述20、seq id no：1-17是可用于本发明的示例性cas12a氨基酸序列。21、seq id no：18-20是可用于本发明的示例性cas12a核苷酸序列。22、seq id no：21-22是编码启动子和内含子的示例性调节序列。23、seq id no：23-29是可用于本发明的示例性胞嘧啶脱氨酶序列。24、seq id no：30-40是可用于本发明的示例性腺嘌呤脱氨酶氨基酸序列。25、seq id no：41是可用于本发明的示例性尿嘧啶-dna糖基化酶抑制剂(ugi)序列。26、seq id no：42-44提供v型crispr-cas12a核酸酶的原间隔子邻近基序位置的实例。27、seq id no：45-47提供可用于本发明的示例性肽标签和亲和多肽。28、seq id no：48-58提供可用于本发明的rna募集基序示例和相应的亲和多肽。29、seq id no：59-60是可用于本发明的cas9多肽序列实例。30、seq id no：61-71是可用于本发明的cas9多核苷酸序列实例。31、seq id no：72是磷饥饿耐受性1(pstol1)基因组序列实例。32、seq id no：73是pstol1编码(cds)序列实例。33、seq id no：74是pstol1多肽序列实例。34、seq id no：75和seq id no：76是可以通过本发明的编辑系统靶向的pstol1基因的部分/片段实例。35、seq id no：77是pstol1多肽seq id no；74的部分，包含pest基序。36、seq id no:78是用于靶向pstol1基因的间隔区序列实例。37、seq id no:79是如本文所述编辑的内源性pstol基因的实例。38、seq id no:80是使用本发明的方法从内源性pstol基因中缺失的内源性pstol基因部分的实例。