一种以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液

本发明涉及家畜繁殖，是一种以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液。背景技术：1、国内外关于马属动物精子低温和冷冻保存稀释液的研究经历了很长时间。目前国内外都有关于马属动物精子保存稀释液的研究报道和专利文献。2、国外报道：2019年1月西班牙萨拉戈萨阿拉贡农业研究所和马繁殖军事中心cristina álvarez，victoria luño，noelia gonzález 等报道20%的马初乳稀释液对驴精子冷冻有良好的效果（cryobiology ，2019，87：110–114），同年7月报道20%的驴初乳稀释液比20%马初乳和20%卵黄稀释液对驴精子冷冻具有更好的保护效果，冷冻精液解冻后精子总活力和运动速度等各项指标显著提高（reproduction in domestic animals，2019，7：94-97.）。2018年阿根廷布宜诺斯艾利斯大学alejandro ferrante,clara baca castex,santiago bruno等报道将卵黄离心液加入精子冷冻稀释液中会对精子活力、膜功能和顶体状态产生有害的影响（journal of equine veterinary science，2018，65：12-18）。2019年西班牙科尔多瓦大学兽医学院j.dorado,m. hidalgo ，d.acha等报道山梨醇是提高精子质量的一种替代品（animal reproduction science，2019，208：1-9）。3、国外专利产品：国外的马稀释液产品已经普及，如法国imv的iｒa 系列、德国的gent a、美国的 e－z mixin 稀释液等。法国的inra82和inra96稀释液已被法国imv卡苏公司商品化售卖，主要以糖盐类和其它添加成分配制。4、国内报道：精液离心后用inｒa82 (法国卡苏科技股份有限公司) 5℃低温保存，有效保存时间不超过72h。inｒa82 稀释液中含有糖类(葡萄糖、乳糖和棉籽糖)、缓冲物质(柠檬酸钠、柠檬酸钾和羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、抗冷冻剂(脱脂奶)、抗生素(青霉素、链霉素)等物质（黑龙江畜牧兽医，2020，(38)20:32－35）。精液稀释液中分别添加白藜芦醇和绿原酸能够显著改善精子质量，提高驴精液的低温保存效果（中国畜牧杂志，2022， （58）5:153—157）。冷冻液中添加40µm的白藜芦醇、5µm的mncl2可以改善驴冻精质量，显著提升冷冻—解冻后精子活力、质膜完整、顶体完整性，减少ros含量，提升抗氧化酶活性（吉林畜牧兽医，2021，12:1—3）。柠檬酸、葡萄糖、卵黄添加量分别为17.0 g/l、15.0g/l和15%时对驴精液常温保存的效果较好（黑龙江畜牧兽医，2018，13:102－104）。以tris为基础的稀释液，对驴精子常温保存和冷冻效果较好（黑龙江畜牧兽医，2017，(09 下):83 －86）。基础液过滤后再添加卵黄的过滤方式、添加200μɡ/100ml或300μɡ/100mlvc的稀释液、添加5%ve的稀释液、添加30%氧化石墨烯的稀释液对驴精子的低温保存效果较好（天津农学院学报，2020，（27）1:53-57）。张文倩，王璐，张强等报道在稀释液中添加 0.06g/l 的葡萄籽原花青素有助于提高驴精液低温保存的质量（黑龙江畜牧兽医，2022，(140)17:52－55）。韩迎雪，高鹏，李楠等报道在稀释液中添加1%、2%、4%、6% 浓度维生素e皆可提高驴精子冷冻解冻后的运动参数、线粒体膜电位、顶体完整率、dna 完整率，降低畸形率，其中2%维生素e效果最佳（中国畜牧杂志，2022，（58）9：179-183）。赵娟，李建栋报道精氨酸和bsa联合添加时对驴精液的精子活率、顶体完整率、质膜完整率都有一定程度的改善作用, 二者联合有一定的协同作用,最佳组合浓度为精氨酸1.0mg/ml、bsa2mg/ml（黑龙江畜牧兽医，2022，(141)18:68-72）。5、国内专利文献：1）2020年太东（镇江）生物科技有限公司申请的《一种驴用精子稀释液及其制备方法和应用》（cn111493062a），以质量计，包括以下组分：tris 30.4±0.5g，柠檬酸17.0±0.2g，葡萄糖7.5±0.1g，牛磺酸12.5±0.2mg，丙酮酸钠36.3±0.5mg，果糖1.5±0.1g，改性卵磷脂2±0.1g，己酮可可碱1.5±0.1g，大豆异黄酮25.4±0.3mg。2）2020年辽宁省现代农业生产基地建设工程中心申请的《一种驴的冷冻精液稀释液配方及其制备方法》（cn111374124a），包含葡萄糖1.2g、柠檬酸1.3g、tris2.4g、甘油5ml、双蒸馏水100ml、卵黄20ml、青霉素1×105iu、链霉素1×105iu。3）2019年山东畜牧兽医职业学院申请《一种驴的精液稀释液及其制备方法》（cn110583630a），包含葡萄糖、乳糖、棉籽糖、五水柠檬酸钠、柠檬酸钾、hepes、edta、卵黄、青链霉素、无菌蒸馏水、脱脂驴奶，还添加了bsa和a溶液，所述a溶液由牛磺酸、l-赖氨酸盐酸盐、肌醇、维生素b6、维生素b12、柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬黄、纯净水组成。4）2017年天津农学院申请《一种驴精液低温保存的方法》（cn107183013a），按质量份数tris 3.04份、柠檬酸1.70份、葡萄糖1.50份、果糖1.50份、青霉素0.06份、链霉素0.10份及双蒸水100份制备基础液，将基础液85份、卵黄液15份制备精液稀释液。6、除了以上国外和国内报道及专利，还有一些较早的报道及申报的驴精子稀释液专利文献和马精子稀释液专利文献普遍采用以上所述糖盐类、脱脂奶、卵黄和生物活性物质及其他添加成分作为稀释液配制的主要成分。7、但上述现有技术驴精子低温保存稀释液保存时间短、配制需要较多的仪器设备、操作人员需要有较高的专业技能、配制程序繁琐、配制难度大、成本高，养殖场或基层人工授精点不能独立完成此项工作，已不能满足要求。技术实现思路1、本发明提供了一种以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有技术驴精子低温保存稀释液保存时间短、配制需要较多的仪器设备、操作人员需要有较高的专业技能、配制程序繁琐、配制难度大、成本高，养殖场或基层人工授精点不能独立完成此项工作，已不能满足要求的问题。2、本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液，按下述步骤得到：第一步，量取80ml至400ml经处理后的室温驴奶和20ml至100ml卵黄混合，加入青霉素10万iu至50万iu、链霉素10万iu至50万iu，在带盖容器中反复震荡30分钟至50分钟，得到混悬液；第二步，混悬液离心处理2次至3次，每次10分钟至20分钟，每次处理后吸取离心液重复操作，得到离心液；第三步，离心液封装后冷冻保存，得到以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液。3、下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：4、上述驴精子低温保存稀释液制备方法中，第二步中，用50ml的离心管分装混悬液以2200转/分钟的转速离心处理；第三步中，按100ml/瓶的剂量进行封装，封装后冷冻保存。5、上述经处理后的室温驴奶按下述步骤得到：第一步，将泌乳驴乳头擦洗干净、消毒后挤奶，挤出的新鲜驴奶过滤；第二步，过滤后的新鲜驴奶置于经消毒后的容器中，煮沸撇去膨起的泡沫，连续2次至4次，直到不再有泡沫膨起，盖上盖子进行冷却；第三步，冷却至室温，过滤后得到经处理后的室温驴奶。6、上述经处理后的室温驴奶制备方法中，第一步中，将泌乳驴乳头用毛巾擦洗干净、用专用消毒液消毒后挤奶，挤出的新鲜驴奶用6层灭菌纱布过滤；第二步中，过滤后的新鲜驴奶置于经消毒后的不锈钢容器中，通过电磁炉煮沸撇去膨起的泡沫；第三步中，冷却至室温，用6层灭菌纱布过滤后，得到经处理后的室温驴奶。7、上述卵黄按下述方法得到：选择3天至5天的新鲜鸡蛋2个至10个，用酒精棉球擦净并消毒鸡蛋外壳，晾干，用镊子轻轻敲开外壳，倒出蛋清，将卵黄放在滤纸上滚动，蘸去蛋清，用去掉针头的注射器插入卵黄膜吸取卵黄20ml至100ml，得到卵黄。8、上述驴奶为产后15日以上的泌乳驴分泌；泌乳驴为无传染病或乳腺疾病且经检疫和健康检测合格的泌乳驴。9、上述驴精子低温保存稀释液的制备过程均在无菌条件下进行。10、本发明驴精子低温保存稀释液由驴奶、卵黄和抗生素组成，较现有技术，大大降低了生产成本、保存时间长效果好且受胎率优于或与现有技术相当；同时相较现有驴精子低温保存稀释液的配置，所需设备简单、配制所需药品种类少、配制程序简单、配制难度小、不需要操作人员有较高的专业技能、一般养殖场或基层人工授精点都能独立完成此项工作；适合规模化养殖场和人工授精点推广使用。11、实施方式12、本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。13、实施例1，该一种以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液，按下述步骤得到：第一步，量取80ml至400ml经处理后的室温驴奶和20ml至100ml卵黄混合，加入青霉素10万iu至50万iu、链霉素10万iu至50万iu，在带盖容器中反复震荡30分钟至50分钟，得到混悬液；第二步，混悬液离心处理2次至3次，每次10分钟至20分钟，每次处理后吸取离心液重复操作，得到离心液；第三步，离心液封装后冷冻保存，得到以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液。本发明驴精子低温保存稀释液由驴奶、卵黄和抗生素组成，较现有技术，大大降低了生产成本、保存时间长效果好且受胎率优于或与现有技术相当；同时相较现有驴精子低温保存稀释液的配置，所需设备简单、配制所需药品种类少、配制程序简单、配制难度小、不需要操作人员有较高的专业技能、一般养殖场或基层人工授精点都能独立完成此项工作；适合规模化养殖场和人工授精点推广使用。本发明驴精子低温保存稀释液对驴精子低温保存时间长且效果好，在2℃至7℃冰箱保存5天至6天，精子活力降低很小，仍然保持较快的运动速度；从第7天开始精子活力显著降低，运动速度变慢，直到第14天仍然有摆动的精子。配合促排卵激素使用配种因母驴膘情、产驹时间和输精剂量等因素影响情期受胎率平均在60%左右。14、实施例2，该一种以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液，按下述步骤得到：第一步，量取80ml经处理后的室温驴奶和20ml卵黄混合，加入青霉素10万iu、链霉素10万iu，在带盖容器中反复震荡30分钟，得到混悬液；第二步，混悬液离心处理2次，每次10分钟，每次处理后吸取离心液重复操作，得到离心液；第三步，离心液封装后冷冻保存，得到以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液。本实施例2驴精子低温保存稀释液对驴精子低温保存时间长且效果好，在7℃冰箱保存6天，精子活力降低很小，仍然保持较快的运动速度；配合促排卵激素使用配种因母驴膘情、产驹时间和输精剂量等因素影响情期受胎率可达65%。15、实施例3，该一种以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液，按下述步骤得到：第一步，量取400ml经处理后的室温驴奶和100ml卵黄混合，加入青霉素50万iu、链霉素50万iu，在带盖容器中反复震荡35分钟，得到混悬液；第二步，混悬液离心处理3次，每次15分钟，每次处理后吸取离心液重复操作，得到离心液；第三步，离心液封装后冷冻保存，得到以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液。本实施例3驴精子低温保存稀释液对驴精子低温保存时间长且效果好，在5℃冰箱保存5天，精子活力降低很小，仍然保持较快的运动速度；配合促排卵激素使用配种因母驴膘情、产驹时间和输精剂量等因素影响情期受胎率可达68%。16、实施例4，该一种以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液，按下述步骤得到：第一步，量取240ml经处理后的室温驴奶和60ml卵黄混合，加入青霉素30万iu、链霉素30万iu，在带盖容器中反复震荡40分钟，得到混悬液；第二步，混悬液离心处理3次，每次15分钟，每次处理后吸取离心液重复操作，得到离心液；第三步，离心液封装后冷冻保存，得到以驴奶为营养液的驴精子低温保存稀释液。本实施例4驴精子低温保存稀释液对驴精子低温保存时间长且效果好，在2℃冰箱保存5天，精子活力降低很小，仍然保持较快的运动速度；配合促排卵激素使用配种因母驴膘情、产驹时间和输精剂量等因素影响情期受胎率可达69%。17、实施例5，作为上述实施例的优化，驴精子低温保存稀释液制备方法中，第二步中，用50ml的离心管分装混悬液以2200转/分钟的转速离心处理；第三步中，按100ml/瓶的剂量进行封装，封装后冷冻保存。18、实施例6，作为上述实施例的优化，经处理后的室温驴奶按下述步骤得到：第一步，将泌乳驴乳头擦洗干净、消毒后挤奶，挤出的新鲜驴奶过滤；第二步，过滤后的新鲜驴奶置于经消毒后的容器中，煮沸撇去膨起的泡沫，连续2次至4次，直到不再有泡沫膨起，盖上盖子进行冷却；第三步，冷却至室温，过滤后得到经处理后的室温驴奶。19、实施例7，作为上述实施例的优化，经处理后的室温驴奶制备方法中，第一步中，将泌乳驴乳头用毛巾擦洗干净、用专用消毒液消毒后挤奶，挤出的新鲜驴奶用6层灭菌纱布过滤；第二步中，过滤后的新鲜驴奶置于经消毒后的不锈钢容器中，通过电磁炉煮沸撇去膨起的泡沫；第三步中，冷却至室温，用6层灭菌纱布过滤后，得到经处理后的室温驴奶。20、实施例8，作为上述实施例的优化，卵黄按下述方法得到：选择3天至5天的新鲜鸡蛋2个至10个，用酒精棉球擦净并消毒鸡蛋外壳，晾干，用镊子轻轻敲开外壳，倒出蛋清，将卵黄放在滤纸上滚动，蘸去蛋清，用去掉针头的注射器插入卵黄膜吸取卵黄20ml至100ml，得到卵黄。21、实施例9，作为上述实施例的优化，驴奶为产后15日以上的泌乳驴分泌；泌乳驴为无传染病或乳腺疾病且经检疫和健康检测合格的泌乳驴。22、 实施例10，作为上述实施例的优化，驴奶为新鲜驴奶。23、本发明驴精子低温保存稀释液的使用方法24、通过假阴道法采精前40min，调整水浴锅水温至37℃，放入低温保存的本发明驴精子低温保存稀释液。开启显微镜自带加热板，将盖玻片、载玻片和待装精液的烧杯预热。25、精液采集过滤后用50ml的离心管分装以2200转/分钟的转速离心10分钟，弃掉上清液，加入与原精等体积的本发明驴精子低温保存稀释液，镜检合格后，用毛巾多层包裹放入2℃的冰箱保存。人工授精时吸入注射器连接驴用输精外套对发情母驴人工授精，每头驴子宫体输入5ml至10ml配置的稀释精液。26、药品和设备来源27、本发明驴精子低温保存稀释液所用驴奶和卵黄为自制，青链霉素由四川鼎尖药业有限责任公司生产；人绒毛膜促性腺激素（hcg）由宁波三生生物科技股份有限公司生产。28、电热恒温水浴锅（型号dzkw-d-2），由北京市永光明医疗仪器有限公司生产；台式低速离心机（型号tdz4-ws），由湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产；兽用b型超声诊断仪由郑州博祥来电子科技有限公司生产；生物显微镜型号为 xsp －t36b-1600x。29、本发明的技术效果验证30、本发明驴精子低温保存稀释液对驴精子低温保存时间长且效果好，在2℃至7℃冰箱保存5天至6天，精子活力降低很小，仍然保持较快的运动速度；从第7天开始精子活力显著降低，运动速度变慢，直到第14天仍然有摆动的精子。配合促排卵激素使用配种因母驴膘情、产驹时间和输精剂量等因素影响情期受胎率平均在60%左右。具体配种方法：通过直肠检查和b超扫描发情母驴两侧卵巢，卵泡发育至3.0cm以上，注射人绒毛膜促性腺激素5000iu，12小时后第一次配种，36小时后第二次配种，之后根据卵泡发育情况可以在48小时或60小时补配1次，直至排卵。31、从生产成本来看，根据市场价格本发明驴精子低温保存稀释液每100ml成本约为10元左右人民币，而相同体积驴精子低温保存稀释液市场售价为100元以上，可以为驴养殖场和人工授精点节约稀释液成本10倍以上。32、本发明驴精子低温保存稀释液由驴奶、卵黄和抗生素组成，和现有驴精子低温保存稀释液相比较，需要设备简单、配制所需药品种类少、配制程序简单、配制难度小、不需要操作人员有较高的专业技能、一般养殖场或基层人工授精点都能独立完成此项工作；单位体积成本远远低于现有市场驴精子稀释液售卖价格；最重要的是精子低温保存配种后获得了较高的受胎率，受胎率优于或与现有技术相当；适合规模化养殖场和人工授精点推广使用。33、综上所述，本发明驴精子低温保存稀释液由驴奶、卵黄和抗生素组成，较现有技术，大大降低了生产成本、保存时间长效果好且受胎率优于或与现有技术相当；同时相较现有驴精子低温保存稀释液的配置，所需设备简单、配制所需药品种类少、配制程序简单、配制难度小、不需要操作人员有较高的专业技能、一般养殖场或基层人工授精点都能独立完成此项工作；适合规模化养殖场和人工授精点推广使用。34、以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。