一种低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法

本发明涉及一种低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法，属于植物育种。背景技术：1、常见的作物育种方法有杂交育种、诱变育种、单倍体育种、多倍体育种、转基因育种等，其中，单倍体育种具有缩短育种年限、提高育种效率等优点，是近年来育种工作者广泛关注或应用的育种方法。在玉米上，使用“单倍体诱导系”比较容易获得单倍体籽粒，因此近年来国内、外玉米育种单位广泛使用单倍体育种方法进行玉米新品种选育。玉米单倍体诱导系是一种特殊的玉米自交系，通常其籽粒种皮、糊粉层和胚尖皆有明显的紫红色，用它作父本给某玉米材料(母本)授粉之后，其后代植株中有百分之几的个体为母源性单倍体，即仅仅含有一套母本的染色体。这种母源性单倍体经过“自然染色体加倍”或“人工染色体加倍”后成为纯合二倍体，不再有性状分离，成为新的纯合自交系，因这些自交系是单倍体的染色体翻倍而成，学者们称这种纯合自交系为双单倍体系(double haploid line)，简称为dh系。2、以单倍体诱导系为基础的玉米单倍体育种技术已成为现代玉米育种的核心技术之一。该技术突破了传统的自交系选育方法的缺点(费工费时、周期长、进度慢等)，将传统方法的“连续多代自交”(7个世代以上的套袋自交)转变为“诱导和加倍单倍体”2个世代即可完成自交系选育工作，获得高纯合度的dh系，大大加快了育种进程。而且dh系的遗传位点纯合度达100％，传统自交系(f8代自交系)的纯合度仅为99.2％。3、目前已报道的单倍体的染色体加倍方法很多，总体上可以分为两类，一类是自然加倍，另一类是人工加倍(化学加倍)。玉米的单倍体由于其细胞中只有一套染色体，其花粉母细胞不能进行正常的减少分裂，花药/花粉都不能正常形成，故玉米的单倍体植株都是雄性不育的。但单倍体在大田栽培中部分植株的染色体会发生加倍，形成二倍体细胞，在开花时雄穗育性恢复或部分恢复，可以给其雌穗授粉，获得种子，这种现象称为单倍体的自然加倍。单倍体的自然加倍百分率根据其基础材料的来源不同而不同，有的加倍率较高，有的加倍率很低，总体上，自然加倍率一般为1％-2％，容易自然加倍的材料，其自然加倍率可以达5％。4、单倍体染色体的人工加倍就是用一些抗微管的药物，处理(浸泡)单倍体幼苗个体或器官，使其茎尖分生组织细胞的有丝分裂被干扰，进而发生染色体加倍。秋水仙碱作为植物染色体加倍的药物使用始于19世纪30年代，使用已近百年，应用的范围非常广泛。近年来，多名学者报道了组织培育法进行玉米单倍体的染色体加倍。由于使用了单倍体的幼胚胚性愈伤组织、并将秋水仙碱加入培育基中，加倍效率大大提高。但组织培育法加倍有明显的缺点：成本高、速度慢、不能规模化处理单倍体籽粒。目前以秋水仙碱处理萌发2-3天的单倍体幼苗(浸芽法)为最常用的方法，一般使用0.06％(等于1.5mm)或更高浓度。这么高浓度的秋水仙碱会对被处理的植物材料产生较大的毒害，产生较高的死苗率或畸形苗率，一般芽苗存活率很低(低于50％)、总加倍成功率只有10％左右，并且操作程序复杂、繁琐，费工费时、成本高，而且这种药物对人身的毒害作用较大。技术实现思路1、本发明的目的在于解决现有玉米单倍体染色体加倍的方法存在的不足，提供一种低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法，该方法操作简单，加倍成功率高，芽苗存活率较高，并且对植物无害，不产生死苗和畸形苗，对人体和环境也无毒无害。2、技术方案3、一种低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法，包括如下步骤：4、(1)将玉米单倍体籽粒消毒后用无菌水清洗干净，然后晾干，接着加入种衣剂进行拌种包衣处理，得到包衣后的玉米单倍体籽粒；5、(2)取消毒并洗净的种子发芽盒，底部垫上无菌发芽纸，加入无菌水将无菌发芽纸润湿后，放入包衣后的玉米单倍体籽粒，再盖上一层润湿的无菌发芽纸，然后置于28℃的恒温培养箱中培养；6、(3)在28℃的恒温培养箱中培养36h后，每隔5-6h观察一次玉米单倍体籽粒的发芽情况，并挑选出初生根长度大于或等于5mm的单倍体籽粒，将挑选出的籽粒装入垫有湿润发芽纸的种子发芽盒内，盖上一层润湿的无菌发芽纸后，置于8-10℃的冷藏箱中低温处理7-21天，结束后取出，得到低温处理后的芽苗；7、(4)将低温处理后的芽苗移栽至育苗穴盘中，在温室内生长至三叶期后，再移栽至大田生长。8、进一步，步骤(1)中，所述消毒方法为：将玉米单倍体籽粒加入到消毒水中浸泡10min，然后取出；所述消毒水由体积比为1:4的84消毒液和水混合制成。9、进一步，步骤(2)中，所述培养时长为2-6天。10、进一步，步骤(3)中，所述低温处理期间，每天回温至常温25℃处理0.5-1.5h，或者每7天回温至常温25℃处理2-3h。11、进一步，步骤(3)中，低温处理期间，每天检查一次种子发芽盒内的水分情况，如发现水分明显损失，就及时喷雾补水。12、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：13、1)本发明提供了一种低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法，该方法流程简单、快速，适用于规模化单倍体籽粒染色体加倍。14、2)与现有的化学方法相比，本发明采用的是低温处理方法，低温对玉米芽苗无毒无害，低温处理结束后，芽苗移栽后存活率很高(>90％)，无畸形苗。而目前的化学法处理(秋水仙碱或抗微管除草剂处理)，芽苗或3叶期幼苗往往受药害很重，芽苗或幼苗移栽后的植株存活率很低，或幼苗移栽后的植株存活率很低；有些研究者用抗微管除草剂取代秋水仙碱进行单倍籽粒或幼苗的染色体加倍，处理成本下降了，但除草剂对植物的毒性更高，处理芽苗或幼苗时，植株的存活率都很低(<50％)。15、3)与现有化学方法相比，本发明方法不用任何药物，只需用冰箱、冷柜降温，设备简单，成本低廉，对人和环境无毒无害；而化学方法需要买秋水仙碱等药物，成本很高。秋水仙碱药剂(95％以上纯度)在市场上最低价格在300元/克以上。一个玉米育种课题组(10余人)每年需要2万元以上的药品费用于购买秋水仙碱。16、4)与现有化学方法比较，本方法用工很少，工时成本低。用秋水仙碱浸芽法则需要将玉米单倍体芽苗进行切芽和切根，药物处理后要反复清洗，因此秋水仙碱浸芽法很费工，使得单倍体加倍处理成本继续攀升。技术特征：1.一种低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法，其特征在于，包括如下步骤：2.如权利要求1所述低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消毒方法为：将玉米单倍体籽粒加入到消毒水中浸泡10min，然后取出；所述消毒水由体积比为1:4的84消毒液和水混合制成。3.如权利要求1所述低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养时长为2-6天。4.如权利要求1所述低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述低温处理期间，每天回温至常温25℃处理0.5-1.5h，或者每7天回温至常温25℃处理2-3h。5.如权利要求1或2或3或4所述低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法，其特征在于，步骤(3)中，低温处理期间，每天检查一次种子发芽盒内的水分情况，如发现水分明显损失，就及时喷雾补水。技术总结本发明公开了一种低温处理促进玉米单倍体染色体加倍的方法。将玉米单倍体籽粒消毒后用无菌水清洗并晾干，加入种衣剂进行拌种包衣。将包衣后的单倍体籽粒放入垫有湿润无菌发芽纸的种子发芽盒内，再盖上润湿的发芽纸，于28℃的恒温培养箱中培养。培养36h后，每隔5‑6h观察一次单倍体籽粒的发芽情况，并挑出初生根长度大于或等于5mm的单倍体籽粒，装入垫有湿润发芽纸的发芽盒内并盖上湿润发芽纸，于8‑10℃的冷藏箱中处理7‑21天，结束后将芽苗移栽至育苗穴盘中，待生长至三叶期后再移栽至大田。与现有方法相比，该方法操作简单，成本低，加倍成功率高，芽苗存活率较高且对植物和人体无毒无害，适用于规模化单倍体籽粒染色体加倍。技术研发人员：严远鑫,赛义德·阿尔沙德,成城,张娟,亓增军,马正强受保护的技术使用者：南京农业大学技术研发日：技术公布日：2024/3/31