一种人α-突触核蛋白预制原纤维诱导小鼠认知障

本发明属于生物，具体涉及一种人α-突触核蛋白预制原纤维诱导小鼠认知障碍模型的构建方法。背景技术：1、由α-突触核蛋白（α-syn）组成的神经元包涵体是帕金森氏病（parkinson’sdisease，pd）和路易体痴呆症（dementia with lewy bodies，dlb）的典型病理特征。大多数pd患者会发展成为痴呆症，表现出认知障碍。α-syn包涵体在脑干核团的存在对运动功能非常重要，其在皮质和海马区的大量存在也预示着与认知障碍的发生相关。海马区具有丰富的路易氏神经突起，这对痴呆的贡献是很显然的。近年来普遍研究认为α-syn的异常聚集是pd发病的核心机制，错误折叠的α-syn聚集体呈放射状淀粉样纤维状，是pd病理标志物路易小体的主要组成成分。近年来许多研究表明异常聚集的α-syn具有类朊病毒样的传播特性，它的原纤维会在多个神经元细胞间迁移传播，最终导致大脑多个区域的神经元死亡。因此，基于α-syn原纤维构建的pd动物模型成为研究热点。采用脑内注射重组α-syn原纤维，利用其在神经元之间传播扩散特性而建立的α-syn原纤维pd模型具有重要的利用价值，因为相比较于pd的经典毒素模型和转基因模型，利用人α-syn原纤维建立的pd动物模型所诱导产生的内源性α-syn 水平更接近于人类的生理水平，并且pd的原纤维动物模型所诱导产生的病理变化和神经元功能障碍更类似于人类的病症。然而，传统的pd模型建立均是从动物黑质部位注射神经毒素（如mptp：1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶或鱼藤酮）或α-syn原纤维，更多的关注点都是在运动症状，并且此类方法建立的pd模型出现个运动症状均需要2个月及以上。当然，注射α-syn原纤维对小鼠认知功能的影响的研究更是少之又少，但是近年来对pd运动症状以外的，比如认知、情绪、嗅觉等症状的研究越来越多地受到研究者的关注，因此，建立一种快速出现认知障碍的动物模型能为更多研究者提供极重要的工具，具有重要的现实和创新意义。技术实现思路1、为解决上述问题，本发明提供了一种人α-突触核蛋白预制原纤维诱导小鼠认知障碍模型的构建方法，用人源α-syn预制成原纤维，使用透射电镜观察验证制备成功后，将其通过脑立体定位注射到小鼠海马部位，在短期内快速获得了小鼠认知功能障碍模型。2、该方法首先建立人α-syn高效原核表达载体pgex-5x-1-syn，然后取200ul pgex-5x-1-syn转化bl21菌株，采用1.0mm iptg于37℃下诱导3 h后分离上清用gst融合蛋白磁珠进行纯化，纯化后选取浓度为9mg/ml的人α-syn在37℃，1000r/min震荡条件下培养6d，制备成为高浓度的人α-syn原纤维并使用透射电镜观察。3、经观察验证制备成功后的人α-syn原纤维被稀释至1-5 mg/ml，通过脑立体定位注射方式将稀释好的α-syn原纤维注射至小鼠的双侧海马区域，快速获得了认知功能缺陷小鼠，并且成功表现出与pd患者类似的运动功能障碍，这个模型有助于阐明人α-syn原纤维注射至海马部位与认知功能障碍存在密切联系，相比于传统的通过黑质部位注射获得pd模型而言，此模型出现认知障碍与运动症状障碍的时间及均有提前，这一点对缩短pd及相关疾病的药物的研发时间有重要的参考和应用价值，也有利于研究者更加的关注认知障碍对神经退行性疾病的影响。4、本发明具备的优点及效果如下：5、1、由于α-syn原纤维相比于α-syn单体而言，更容易产生毒性；直接注射人源性α-syn原纤维，更接近于人类pd的路易体主要成分，模型更具有意义。6、2、海马双侧部位注射一定浓度的α-syn原纤维，在1个月（30天）后海马即出现α-syn高表达，表现出明显的认知障碍及运动功能障碍。相比于传统的通过黑质部位注射神经毒素或α-syn原纤维获得pd模型而言，此认知障碍模型出现症状的时间均有提前，对此领域的研究者可提供重要的理论基础和应用价值。另外，通过海马区注射α-syn原纤维构建认知功能障碍模型在国内外没有文献报道，属于一个创新点。7、4、此模型建立的方法具有快速、高效的特点，对研究α-syn原纤维功能和建立认知障碍模型具有良好的参考价值。技术特征：1.一种人α-突触核蛋白预制原纤维诱导小鼠认知障碍模型的构建方法，其特征在于经过下列操作：将人α-syn原纤维通过脑立体定位注射至小鼠海马体双侧部位，即获得小鼠认知功能障碍模型。2.根据权利要求1所述的人α-突触核蛋白预制原纤维诱导小鼠认知障碍模型的构建方法，其特征在于：所述人α-syn原纤维是通过人源α-突触核蛋白预制成原纤维，再使用透射电镜进行检测验证制备成功。3.根据权利要求1所述的人α-突触核蛋白预制原纤维诱导小鼠认知障碍模型的构建方法，其特征在于：所述人α-syn原纤维的浓度是1-5mg/ml。技术总结本发明公开一种人α‑突触核蛋白预制原纤维诱导小鼠认知障碍模型的构建方法，属于生物技术领域。本发明首先将人α‑syn的原核表达载体pGEX‑5X‑1‑syn转化至BL21菌株，采用IPTG诱导后再用高效率的GST融合蛋白纯化磁珠进行蛋白纯化，纯化后的人α‑syn在37℃，1000 r/min震荡条件下培养数天，成功制备了人α‑syn原纤维，最后通过脑立体定位注射方式注射至小鼠海马部位，在短期内快速获得了小鼠认知功能障碍模型。此模型建立的方法具有快速、高效的特点，对研究α‑syn原纤维功能和建立认知障碍模型具有良好的参考价值。技术研发人员：黄璋琼,范胜涛,唐东红,叶尤松,马开利,潘玥,罗海玉受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所技术研发日：技术公布日：2024/3/31