抗黑胫病植物及用于鉴定抗黑胫病植物的方法与

背景技术：1、黑胫病或茎溃疡病是欧洲油菜(brassica napus l.)(油菜(oilseed rape或canola))的主要疾病，每年在全世界(特别是欧洲、澳大利亚和北美)造成重大经济损失。黑胫病由真菌病原体十字花科小球腔菌(leptosphaeria maculans)(无性型黑胫茎点霉(phoma lingam tode ex.fr.))引起。十字花科小球腔菌症状可发生在子叶、叶、荚果和茎上。在感染风传播的子囊孢子和/或水(飞溅)传播的分生孢子后，发生叶病变。茎症状(或溃疡)可以通过茎的直接感染或通过叶病变的真菌的系统性生长，通过维管组织进入茎而引起(hammond等人(1985),plant pathology[植物病理学]34:557-565)。茎溃疡可能会环绕茎，这可能导致植物倒伏和植物死亡。不太严重的溃疡可能导致水和养分流动受限，进而可能导致种子和荚果萎缩。荚果感染可能导致过早的荚果破碎和种子感染。2、将黑胫病抗性引入欧洲油菜栽培品种是全球育种计划的主要目标之一。虽然喷洒杀真菌剂和栽培措施两者均用于减少黑胫病感染造成的产量损失，但迄今为止最可靠的控制方法是遗传抗性。欧洲油菜(2n＝38，基因组aacc)是双二倍体物种，源于芜菁(brassicarapa l.)(异名白菜型油菜(b.campestris)；2n＝20，aa)和甘蓝(brassica oleracea l.)(2n＝18，cc)的自发杂交。欧洲油菜包含这两个二倍体基因组的完整染色体组。3、植物抗性是对抗黑胫病的有力工具。在温室或田间实验中评估了黑胫病抗性。此外，可以在植物发育的不同阶段对黑胫病抗性进行评估。因此，当提到黑胫病抗性时，通常根据所评估的植物阶段和组织区分不同类型的抗性，如幼苗抗性(“早期”抗性)和成株抗性(‘晚期’或‘茎’抗性)。分析抗性的植物组织是例如子叶、叶和茎基。据报道，对黑胫病的遗传抗性是单基因的(在一个主要基因的控制下)或多基因的(在几个次要基因的控制下)。4、已在欧洲油菜中定位了许多抗性基因座。对半活体真菌病原体十字花科小球腔菌的抗性主要由种族特异性r基因控制。据报道，超过15个r基因(在几种芸苔属(brassica)物种中鉴定的)传递对十字花科小球腔菌的种族特异性抗性。经由连锁作图，已将这些r基因中的12个定位在欧洲油菜或芜菁的a基因组(rlm1、rlm2、rlm3、rlm4、rlm7、rlm9、lepr1、lepr2、lepr3、lepr4)或芥菜(b.juncea)的b基因组(lmjr1、lmjr2)(larkan等人(2016)single r gene introgression lines for accurate dissection of the brassica-leptosphaeria pathosystem.[用于准确剖析芸苔属(brassica)-小球腔菌属(leptosphaeria)病变系统的单r基因渗入系]front.plant sci.[植物科学前沿]7:1771.doi:10.3389/fpls.2016.01771)。怀疑rlm3、rlm4、rlm7和rlm9是与十字花科小球腔菌无毒基因avrlm3(rlm3)、avrlm4-7(rlm4和rlm7)和avrlm5-9(rlm9)相互作用的等位基因r基因(dolatabadian等人(2022)canadian journal of plant pathology[加拿大植物病理学杂志],44:2,157-190)。5、us 7,893,325描述了欧洲油菜植物，其在8号染色体上包含源自芜菁的十字花科小球腔菌抗性基因，其中所述抗性基因与8号染色体上的aflp标志物e32/m50-m362和p34/m48-m283相关。6、wo 2008/101343 a1描述了赋予植物黑胫病抗性的方法，该方法包括：引入包含编码lepr3的核酸分子的核酸分子。7、wo 2015/038469 a1描述了欧洲油菜中黑胫病抗性基因rlm2的分子标志物。8、wo 2015/038470 a1描述了欧洲油菜中黑胫病抗性基因rlm4的分子标志物。9、wo 2020/036950 a1描述了欧洲油菜中黑胫病抗性基因rlm1的分子标志物。10、wo 2020/036954 a1描述了欧洲油菜中黑胫病抗性基因rlm7的分子标志物。11、ncbi参考序列xp_013589432.1是来自甘蓝的推定细胞壁相关受体激酶样10(部分)。12、需要鉴定新的抗性基因来源、用于将这些基因来源转移到具有高农艺性能表现的品种的方法以及增强抗性持久性的方法。13、本发明(包括在说明书和权利要求中提供的不同实施例)提供了包含黑胫病抗性基因rlm3的植物，用于将rlm3转移到植物中的方法和手段，以及检测植物中是否存在rlm3的方法。技术实现思路1、本发明提供了用于产生抗黑胫病植物的方法，该方法包括将包含黑胫病抗性基因座rlm3的多核苷酸引入植物基因组的步骤，其中所述rlm3基因座包含至少一个具有选自由以下组成的组的核酸序列的多核苷酸：2、a)如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列；和3、b)与seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，以及4、c)与seq id no:1的nt 2106至9496、seq id no:1的nt 2106-4688或seq id no:1的nt 5908-9496具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的核酸序列。5、本发明进一步提供了用于产生抗黑胫病植物的方法，该方法包括将至少一个包含rlm3相关开放阅读框的多核苷酸引入植物基因组的步骤，其中所述rlm3相关开放阅读框编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：6、a)如seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列；7、b)与seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；8、c)由以下核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列与如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；9、d)a)至c)中任一项的部分序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性。10、在一个实施例中，本发明的上述方法进一步包括11、i)鉴定已将所述多核苷酸整合到其基因组中的植物；以及12、ii)从所述植物产生子代，其中已将黑胫病抗性赋予所述子代。13、本发明还提供了赋予植物黑胫病抗性的方法，该方法包括对包含rlm3相关开放阅读框的编码多肽的基因的沉默等位基因进行基因修饰的步骤，使得该沉默等位基因能够表达所述多肽，其中所述rlm3相关开放阅读框编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：14、a)如seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列；15、b)与seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；16、c)由以下核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列与如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；17、d)a)至c)中任一项的部分序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性。18、在上述方法的实施例中，沉默等位基因通过同源重组或基因组编辑技术修饰。19、本发明还考虑了用于产生抗黑胫病植物的方法，该方法包括将至少一个包含rlm3相关开放阅读框的多核苷酸引入植物基因组的步骤，其中所述rlm3相关开放阅读框编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：20、a)如seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列；21、b)与seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；22、c)由以下核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列与如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；23、d)a)至c)中任一项的部分序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性。24、在上述方法的一个实施例中，使用同源重组或基因组编辑技术。25、此外，本发明涉及用于制造食品(例如，油、粗粉、淀粉、面粉或蛋白质)、饲料(例如，油、粗粉、淀粉、面粉或蛋白质)或工业产品(例如，生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养物)的方法，该方法包括：26、i)通过本发明的方法赋予植物黑胫病抗性，以及27、ii)从步骤i)获得的植物制备该食品、饲料或工业产品。28、本发明进一步涉及用于评估植物黑胫病抗性的方法，该方法包括以下步骤：29、i)确定在包含基因组dna的所述植物的样品中是否存在黑胫病抗性基因座rlm3或包含rlm3相关开放阅读框的多核苷酸，其中30、i)所述rlm3基因座包含至少一个具有选自由以下组成的组的核酸序列的多核苷酸：31、a)如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列；和32、b)与seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；33、c)与seq id no:1的nt 2106至9496、seq id no:1的nt 2106-4688或seq id no:1的nt 5908-9496具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的核酸序列34、并且35、ii)所述rlm3相关开放阅读框编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：36、a)如seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列；37、b)与seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；38、c)由以下核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列与如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；39、d)a)至c)中任一项的部分序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；40、以及41、ii)基于所述植物中所述黑胫病抗性基因座rlm3的存在或不存在来评估该植物的黑胫病抗性。42、本发明还涵盖用于评估植物黑胫病抗性的方法，该方法包括以下步骤：43、i)确定在包含蛋白质的所述植物的样品中是否存在由rlm3相关开放阅读框编码的多肽，其中所述rlm3相关开放阅读框编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：44、a)如seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列；45、b)与seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；46、c)由以下核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列与如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；47、d)a)至c)中任一项的部分序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；48、以及49、ii)基于由rlm3相关开放阅读框编码的所述多肽的存在或不存在来评估该植物的黑胫病抗性。50、此外，本发明涉及植物中黑胫病抗性基因座rlm3用于评估黑胫病抗性或包含rlm3相关开放阅读框的多核苷酸的用途，其中51、i)所述rlm3基因座包含至少一个具有选自由以下组成的组的核酸序列的多核苷酸：52、a)如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列，53、b)与seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；以及54、c)与seq id no:1的nt 2106至9496、seq id no:1的nt 2106-4688或seq id no:1的nt 5908-9496具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的核酸序列，并且55、ii)所述rlm3相关开放阅读框编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：56、a)如seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列；57、b)与seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；58、c)由以下核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列与如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；59、d)a)至c)中任一项的部分序列，其中所述多肽优选地能够赋予植物黑胫病抗性。60、本发明进一步涉及多核苷酸，该多核苷酸包含选自由以下组成的组的核酸序列：61、a)如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列；和62、b)与seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，以及63、c)与seq id no:1的nt 2106至9496、seq id no:1的nt 2106-4688或seq id no:1的nt 5908-9496具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。64、此外，本发明设想多核苷酸，该多核苷酸编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：65、a)如seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列；66、b)与seq id no:5、43和45中任一个所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；67、c)由以下核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列与如seq id no:1、4、42和44中任一个所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性；68、d)a)至c)中任一项的部分序列，其中所述多肽能够赋予植物黑胫病抗性。69、在本发明的实施例中，多核苷酸与异源性启动子可操作地连接。70、本发明进一步涉及寡核苷酸，其与多核苷酸特异性杂交，并且能够用作引物或探针。71、本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体或基因构建体。72、本发明还涉及包含本发明的多核苷酸或本发明的载体或基因构建体的宿主细胞。73、本发明还涉及植物，该植物包含本发明的多核苷酸、本发明的载体或基因构建体、本发明的宿主细胞、或可通过本发明的方法获得的植物细胞。在另外的实施例中，此植物在其基因组中包含至少一个选自由rlm4、rlm7和rlm9组成的组的另外的黑胫病抗性基因。74、本发明还涉及由本发明的多核苷酸编码的多肽。75、本发明还涉及特异性识别本发明的多肽的抗体。76、本发明还涉及用于评估植物黑胫病抗性的试剂盒，该试剂盒包含本发明的寡核苷酸或本发明的抗体。77、此外，本发明涉及确定生物样品(如植物组织样品)中是否存在本发明的rlm3多核苷酸的方法，该方法包括提供来自所述生物样品的dna，以及分析所述dna是否存在所述rlm3多核苷酸。78、此外，本发明涉及确定生物样品(如植物组织样品)中是否存在本发明的rlm3多肽的方法，该方法包括提供来自所述生物样品的多肽，以及分析所述多肽是否存在所述rlm3多肽。79、还提供了用于保护田间栽培植物的方法，其中所述植物是根据本发明的植物，所述植物进一步包含至少一种赋予除草剂耐受性的抗性基因，并且其中所述方法包括将所述除草剂施用于这些栽培植物以控制杂草。80、在实施例中，除草剂是草铵膦(glufosinate)、草铵膦铵盐(glufosinateammonium)或草甘膦。