一种高效油莎豆多倍体诱导方法

本发明涉及植物组织培养，具体涉及一种高效油莎豆多倍体诱导方法。背景技术：1、油莎豆(cyperus esculentus l.)是莎草科莎草属植物，茎三棱形，叶丛生，分蘖力极强。油莎豆地下部匍匐茎顶端膨大成茎豆，主要用于榨油或制粉，是优质、高产和综合利用前景广阔的经济作物。油莎豆是无性繁殖植物，主要以营养器官茎豆为收获对象，因此采用多倍体诱导的方法来提高产量和质量以及改良种质至关重要。2、植物染色体组加倍以后，经常会带来一些形态和生理上得变化，如表现出营养器官的“巨大性”、植株抗逆性增强等；从内部代谢来看，因基因剂量加大，某些代谢物的产量也比二倍体增多。因而多倍体诱导被广泛应用于植物育种工作。油莎豆遗传基础狭窄、种质资源相对缺乏，育种方法单一，多倍体诱导成为其遗传种质改良的有效手段。3、早期多倍体诱导方法主要采用原位诱导法，虽然能获得多倍体，但嵌合体几率比较高。近年来随着生物技术的发展，离体培养加倍法因试验条件易于控制、结果重复性强、变异植株回复突变现象减少等优点，在大多数植物多倍体诱导中备受欢迎。对于油莎豆多倍体诱导的材料选择主要有：种子、愈伤组织、丛生芽、子叶和叶片、根部等。例如现有研究成果包括以油莎豆作为实验材料进行离体培养，包括丛生芽增殖、愈伤组织诱导及再生和生根诱导，建立油莎豆无菌苗快繁及植株再生体系，通过探究秋水仙素对油莎豆无菌苗的浸渍浓度和时间，建立油莎豆多倍体诱导体系。但是现有研究建立的油莎豆多倍体诱导体系还存在加倍易出现嵌合体等问题。因此对油莎豆多倍体诱导体系进行优化改进，提高诱导效率，降低嵌合体率，对油莎豆种质资源的优化发展具有重要的意义。技术实现思路1、为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种高效油莎豆多倍体诱导方法，以芽点为诱导材料，能有效提高诱导效率、降低嵌合体率。2、为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：3、一种高效油莎豆多倍体诱导方法，包括以下操作步骤：4、1)油莎豆茎豆浸泡：选取油莎豆茎豆在无菌水中浸泡完全吸胀；5、2)获取芽点：从步骤1)完全吸胀的茎豆上挖取芽点；6、3)芽点灭菌：对步骤2)获取的芽点进行灭菌处理；7、4)芽点诱导发芽：将步骤3)灭菌处理后的芽点接种至茎尖萌发培养基，培育芽点萌发；8、5)多倍体诱导：将步骤4)萌发良好，无污染的芽点浸泡在秋水仙碱溶液进行多倍体诱导；9、6)将步骤5)完成多倍体诱导的芽点依次恢复培养、增殖培养、多倍体检测和生根培养。10、可选的，步骤5)中秋水仙碱溶液为含2wt％tritonx-100的2.0g﹒l-1的秋水仙碱溶液。11、可选的，步骤5)中秋水仙碱溶液为将秋水仙碱粉末溶于浓度8.5g﹒l-1氯化钠溶液，并添加2％的tritonx-100，配置成2.0g﹒l-1的秋水仙碱溶液，用0.22μm的滤膜过滤除菌。12、可选的，步骤5)中将芽点浸泡在秋水仙碱溶液的具体方法为：将芽点至于秋水仙碱溶液中，置于摇床，黑暗条件下，25℃下处理24h。13、具体的，摇床转速为75～90rpm/min。14、可选的，步骤3)中的灭菌处理具体为将芽点转移至2.0ml无菌离心管中，加入70％的乙醇,上下颠倒震荡20～50s，无菌水清洗3～6次；加入10％次氯酸钠溶液，颠倒震荡8～10min，无菌水清洗3～6次，直到无泡沫、溶液清澈为止，整个过程在无菌环境中操作。15、可选的，步骤1)中选取油莎豆茎豆在无菌水中浸泡完全吸胀的具体方法为：选取无虫害、饱满、形态均匀一致的油莎豆茎豆浸泡在无菌水中，每隔6～8h换一次无菌水，持续浸泡48h。16、可选的，步骤2)挖取芽点的具体方法为：用刀片挖取芽点部分，在体视镜下去除包裹茎尖的鳞片，获得白色无杂物的萌动芽尖，置于无菌水中，备用。17、可选的，步骤4)中的茎尖萌发培养基为：ms基本培养基+30g﹒l-1蔗糖+10g﹒l-1琼脂+0.5mg﹒l-1 6-ba；18、步骤4)培育芽点萌发的培养条件为：温度22～24℃，光照强度29.6k lux，光照时间16h。19、可选的，步骤6)中恢复培养的具体方法为：无菌环境下，将步骤5)处理的芽点，用无菌水清洗干净后，无菌滤纸吸干表面水分，转移至恢复培养基中恢复培养；20、恢复培养的具体条件为：温度22℃、光周期16h光照/8h黑暗；21、增殖培养的具体方法为：将恢复培养后的芽点移至增殖培养基中进行增殖培养，形成多个分蘖；22、恢复培养和增殖培养的培养基为：ms+30g﹒l-1蔗糖+10g﹒l-1琼脂+0.5mg﹒l-1 6-ba；23、生根培养具体方法为：将鉴定为多倍体的分蘖簇分离开，转接到生根培养基中，获得生根苗；24、生根培养基为：ms+30g﹒l-1蔗糖+10g﹒l-1琼脂。25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：26、本发明首次以无菌水浸泡完全吸胀的油莎豆茎豆剥取的芽点为诱导材料，灭菌诱导发芽萌发后，加入秋水仙碱溶液浸泡法进行多倍体诱导，减少油莎豆组培过程的污染率，显著提高油莎豆多倍体的诱导率、成活率，有效降低嵌合体发生率；27、进一步的，本发明优化秋水仙碱溶液配方，加入tritonx-100，提高多倍体诱导率；28、更进一步的，本发明优化组培过程中芽点萌芽培育、恢复培养、增殖培养和生根培养培养基及培育过程，提高多倍体成活率。技术特征：1.一种高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，包括以下操作步骤：2.如权利要求1所述的高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，步骤5)中秋水仙碱溶液为含2wt％tritonx-100的2.0g﹒l-1的秋水仙碱溶液。3.如权利要求2所述的高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，步骤5)中秋水仙碱溶液为将秋水仙碱粉末溶于浓度8.5g﹒l-1氯化钠溶液，并添加2％的tritonx-100，配置成2.0g﹒l-1的秋水仙碱溶液，用0.22μm的滤膜过滤除菌。4.如权利要求2或3所述的高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，步骤5)中将芽点浸泡在秋水仙碱溶液的具体方法为：将芽点至于秋水仙碱溶液中，置于摇床，黑暗条件下，25℃下处理24h。5.如权利要求4所述的高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，摇床转速为75～90rpm/min。6.如权利要求5所述的高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，步骤3)中的灭菌处理具体为将芽点转移至无菌离心管中，加入70％的乙醇,上下颠倒震荡20～50s，无菌水清洗3～6次；加入10％次氯酸钠溶液，颠倒震荡8～10min，无菌水清洗3～6次，直到无泡沫、溶液清澈为止。7.如权利要求6所述的高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，步骤1)中选取油莎豆茎豆在无菌水中浸泡完全吸胀的具体方法为：选取无虫害、饱满、形态均匀一致的油莎豆茎豆浸泡在无菌水中，每隔6～8h换一次无菌水，持续浸泡48h。8.如权利要求7所述的高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，步骤2)挖取芽点的具体方法为：用刀片挖取芽点部分，在体视镜下去除包裹茎尖的鳞片，获得白色无杂物的萌动芽尖，置于无菌水中，备用。9.如权利要求8所述的高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，步骤4)中的茎尖萌发培养基为：ms基本培养基+30g﹒l-1蔗糖+10g﹒l-1琼脂+0.5mg﹒l-1 6-ba；10.如权利要求9所述的高效油莎豆多倍体诱导方法，其特征在于，步骤6)中恢复培养的具体方法为：无菌环境下，将步骤5)处理的芽点，用无菌水清洗干净后，无菌滤纸吸干表面水分，转移至恢复培养基中恢复培养；技术总结本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种高效油莎豆多倍体诱导方法。本发明首次以无菌水浸泡完全吸胀的油莎豆茎豆剥取的芽点为诱导材料，灭菌诱导发芽萌发后，加入秋水仙碱溶液浸泡法进行多倍体诱导，减少油莎豆组培过程的污染率，显著提高油莎豆多倍体的诱导率、成活率，有效降低嵌合体发生率。技术研发人员：陆平利,王猛,王艳,胡可,田怡琳,孔祥超,朱嘉莹,关培培受保护的技术使用者：河南大学技术研发日：技术公布日：2024/3/31