一种茶树干细胞低温保存的方法与流程

本技术涉及干细胞冻存，尤其是涉及一种茶树干细胞低温保存的方法。背景技术：1、植物干细胞为传统植物解剖学范畴中的分生组织，包括茎尖分生组织、根尖分生组织、侧生分生组织以及部分髓射线细胞，其具有产生所有分化细胞类型的能力以及旺盛的分裂能力和较高的遗传稳定性。植物干细胞具有多个小液泡、线粒体活性高、聚集度低、细胞壁无木质素沉积等特点，低温保藏后仍维持较高的细胞活性，在悬浮培养过程中大部分以单细胞形式存在，对剪切力不敏感，能维持稳定的增殖速度，可以长期稳定培养。2、随着我国制药工业及功能性食品行业的迅速发展，对植物中活性成分的需求日益增长。茶属多年生木本植物，茶叶含有茶多酚、茶氨酸和儿茶素等多种生理活性物质，具有抗氧化、抗衰老、抗k、抗过敏等功效，可制成较高营养价值和药用价值的保健饮料。茶中的活性成分具有多种对人体有益的作用，同样具备药用价值。目前，现有技术中还有使用茶干细胞制备化妆品的文献报道。3、然而，茶作为木本植物，茶的品质受环境因素和收获条件的影响，活性物质产量并无稳定，具有极强的个体化差异。以茶叶为原料，采用现代提取工艺制备对应的活性成分，效费比极高，且品质难以保证，并不能满足制药工业及功能性食品行业的需要。对于以茶干细胞为原料的化妆品领域，更加无法以茶叶为原料。以生物技术，选择特定的高品质茶树，分离其干细胞，制备活性成分，以及通过增殖培养制备干细胞，是目前较为可行，且效费比较高的选择。此外，提取茶干细胞，对于研究茶树品种特性，进行病害防治研究，改良茶树品种等方面，也有重要意义。4、然而，采用上述方法，制备茶的活性成分，以及通过增殖培养制备茶干细胞等，均需要对分离提取的茶干细胞冻存备用。目前本领域并无茶干细胞冻存的相关技术报道，如何解决茶干细胞的冻存，是本领域亟待解决的技术问题。技术实现思路1、为了解决上述至少一种技术问题，开发一种能够有效对茶干细胞冻存保存，并且能够有效保证冻存细胞的活性，使之能够在使用时有效复苏的保存方法，本技术提供一种茶树干细胞低温保存的方法。2、本技术提供的一种茶树干细胞低温保存的方法，包括以下步骤：3、s1、以选定的茶嫩叶为原料，分离、提取茶干细胞；4、s2、将步骤s1分离、提取的茶干细胞，用pbs清洗，离心沉淀，得到清洗后的茶干细胞；5、s3、配置冻存液，将步骤s2得到的清洗后的茶干细胞接种至冻存液中，重悬，制得重悬液；6、s4、将步骤s3制得的重悬液，在0~4℃温度下培养4~10h，而后降温至-25~-35℃预冻1~2h，再而后降温至-80℃以下冷冻2~4h，最后移至液氮中冻存保存；7、所述步骤s3中，冻存液各组分质量分数配比为：基础培养基40~50%，聚天冬氨酸3~6%，聚乙烯吡咯烷酮1~3%，海藻糖6~10%，甘露醇2~4%，小牛血清2~5%，还原性谷胱甘肽1~3%，余量为ph7.2~7.5的pbs缓冲液。8、通过采用上述技术方案，本技术设计了一种针对茶干细胞的低温冻存的保存方法，在本技术前并无类似的冻存技术存在于现有技术的记载中，本技术为制备优质茶活性成分，制备优质茶干细胞，以及茶树品种改良和虫害防治提供了干细胞保存手段；本技术以茶嫩叶为原料，分离、提取茶干细胞，得到的茶干细胞品质优良，具备良好的增殖能力，同时具有高效制备茶活性成分的能力；本技术采用特定设计的冻存液，对茶干细胞具有良好的保护，能够有效维持茶干细胞在低温冻存下的活性；本技术设计了特定的冻存步骤，采用低温适应性培养，配合逐步降温的冷冻步骤，能够尽可能降低冷冻过程中对茶干细胞的损害，有效保证了茶干细胞在低温冻存下的活性。9、可选的，所述步骤s1中，分离、提取茶干细胞，采用以下步骤：10、s1-1、将茶嫩叶粉碎，接种在dmem培养基中，常温培养14~21d；11、s1-2、将步骤s1-1培养后的茶嫩叶，挑取大块增殖细胞群落，接种在新鲜的dmem培养基中，常温培养5~7d；12、s1-3、将步骤s1-2培养后的细胞群落，滤除培养基，得到茶干细胞。13、进一步可选的，所述步骤s1-2中，接种密度控制在1×108~1×1010个/ml。14、可选的，所述步骤s2中，所述pbs清洗，离心沉淀的步骤，重复1~2次。15、可选的，所述步骤s3中，冻存液各组分质量分数配比为：基础培养基44~46%，聚天冬氨酸4~6%，聚乙烯吡咯烷酮2~3%，海藻糖7~8%，甘露醇2.5~3%，小牛血清2~3%，还原性谷胱甘肽2~3%，余量为ph7.4的pbs缓冲液。16、可选的，所述步骤s3中，接种密度控制在1×107~1×108个/ml。17、可选的，所述步骤s4中，在0~4℃温度下培养7~8h。18、可选的，所述步骤s4中，降温至-25~-35℃的降温速率控制在2~4℃/min。19、可选的，所述步骤s4中，降温至-80℃以下的降温速率控制在4~6℃/min。20、可选的，所述步骤s4中，将步骤s3制得的重悬液，在2~3℃温度下培养7~8h；而后以2~4℃/min的降温速率，降温至-30℃预冻1~2h；再而后以4~6℃/min的降温速率，降温至-80℃冷冻3~4h，最后移至液氮中冻存保存。21、综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：22、1. 本技术设计了一种针对茶干细胞的低温冻存的保存方法，在本技术前并无类似的冻存技术存在于现有技术的记载中，本技术为制备优质茶活性成分，制备优质茶干细胞，以及茶树品种改良和虫害防治提供了干细胞保存手段。23、2. 本技术以茶嫩叶为原料，分离、提取茶干细胞，得到的茶干细胞品质优良，具备良好的增殖能力，同时具有高效制备茶活性成分的能力。24、3. 本技术采用特定设计的冻存液，对茶干细胞具有良好的保护，能够有效维持茶干细胞在低温冻存下的活性。25、4. 本技术设计了特定的冻存步骤，采用低温适应性培养，配合逐步降温的冷冻步骤，能够尽可能降低冷冻过程中对茶干细胞的损害，有效保证了茶干细胞在低温冻存下的活性。26、实施方式27、以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。28、本技术设计了一种茶树干细胞低温保存的方法，包括以下步骤：29、s1、以选定的茶嫩叶为原料，分离、提取茶干细胞；30、s2、将步骤s1分离、提取的茶干细胞，用pbs清洗，离心沉淀，得到清洗后的茶干细胞；31、s3、配置冻存液，将步骤s2得到的清洗后的茶干细胞接种至冻存液中，重悬，制得重悬液；32、s4、将步骤s3制得的重悬液，在0~4℃温度下培养4~10h，而后降温至-25~-35℃预冻1~2h，再而后降温至-80℃以下冷冻2~4h，最后移至液氮中冻存保存；33、所述步骤s3中，冻存液各组分质量分数配比为：基础培养基40~50%，聚天冬氨酸3~6%，聚乙烯吡咯烷酮1~3%，海藻糖6~10%，甘露醇2~4%，小牛血清2~5%，还原性谷胱甘肽1~3%，余量为ph7.2~7.5的pbs缓冲液。34、分离、提取茶干细胞，采用以下步骤：35、s1-1、将茶嫩叶粉碎，接种在dmem培养基中，常温培养14~21d；36、s1-2、将步骤s1-1培养后的茶嫩叶，挑取大块增殖细胞群落，接种在新鲜的dmem培养基中，常温培养5~7d；37、s1-3、将步骤s1-2培养后的细胞群落，滤除培养基，得到茶干细胞。38、以下为本技术制备例39、制备例140、本制备例分离、提取茶干细胞，采用以下步骤：41、s1-1、将茶嫩叶粉碎至粒度2mm以下，接种在dmem培养基中，常温培养14d；42、s1-2、将步骤s1-1培养后的茶嫩叶，挑取大块增殖细胞群落，接种在新鲜的dmem培养基中，接种密度1×107个/ml，常温培养5d；43、s1-3、将步骤s1-2培养后的细胞群落，滤除培养基，得到茶干细胞。44、制备例245、本制备例分离、提取茶干细胞，采用以下步骤：46、s1-1、将茶嫩叶粉碎至粒度2mm以下，接种在dmem培养基中，常温培养21d；47、s1-2、将步骤s1-1培养后的茶嫩叶，挑取大块增殖细胞群落，接种在新鲜的dmem培养基中，接种密度1×1011个/ml，常温培养7d；48、s1-3、将步骤s1-2培养后的细胞群落，滤除培养基，得到茶干细胞。49、制备例350、本制备例分离、提取茶干细胞，采用以下步骤：51、s1-1、将茶嫩叶粉碎至粒度2mm以下，接种在dmem培养基中，常温培养16d；52、s1-2、将步骤s1-1培养后的茶嫩叶，挑取大块增殖细胞群落，接种在新鲜的dmem培养基中，接种密度1×108个/ml，常温培养5d；53、s1-3、将步骤s1-2培养后的细胞群落，滤除培养基，得到茶干细胞。54、制备例455、本制备例分离、提取茶干细胞，采用以下步骤：56、s1-1、将茶嫩叶粉碎至粒度2mm以下，接种在dmem培养基中，常温培养18d；57、s1-2、将步骤s1-1培养后的茶嫩叶，挑取大块增殖细胞群落，接种在新鲜的dmem培养基中，接种密度1×1010个/ml，常温培养6d；58、s1-3、将步骤s1-2培养后的细胞群落，滤除培养基，得到茶干细胞。59、制备例560、本制备例分离、提取茶干细胞，采用以下步骤：61、s1-1、将茶嫩叶粉碎至粒度2mm以下，接种在dmem培养基中，常温培养20d；62、s1-2、将步骤s1-1培养后的茶嫩叶，挑取大块增殖细胞群落，接种在新鲜的dmem培养基中，接种密度1×109个/ml，常温培养7d；63、s1-3、将步骤s1-2培养后的细胞群落，滤除培养基，得到茶干细胞。64、对本技术制备例1~5进行细胞品质的鉴定和培养过程的监测。65、制备例3和制备例4的工艺，二次细胞群落培养得到的层干细胞系最为完整，活性也最佳。制备例5同样能获得相对完整的层干细胞，活性也较好，略低于制备例3和制备例4。66、以下为本技术实施例67、本技术实施例采用的原料皆来自市售产品，采用本技术制备例4制备茶干细胞。68、实施例69、本实施例的冻存液各组分质量分数配比为：基础培养基40%，聚天冬氨酸6%，聚乙烯吡咯烷酮3%，海藻糖10%，甘露醇4%，小牛血清5%，还原性谷胱甘肽3%，余量为ph7.2的pbs缓冲液。70、本实施例的保存方法，包括以下步骤：71、s1、以制备例4的方法，分离、提取茶干细胞；72、s2、将步骤s1分离、提取的茶干细胞，用pbs清洗1次，离心沉淀，得到清洗后的茶干细胞；73、s3、配置冻存液，将步骤s2得到的清洗后的茶干细胞接种至冻存液中，重悬，制得重悬液，接种密度1×106个/ml；74、s4、将步骤s3制得的重悬液，在0℃温度下培养4h；而后以5℃/min的降温速率，降温至-35℃预冻2h；再而后以10℃/min的降温速率，降温至-80℃冷冻4h，最后移至液氮中冻存保存。75、实施例76、本实施例的冻存液各组分质量分数配比为：基础培养基50%，聚天冬氨酸3%，聚乙烯吡咯烷酮1%，海藻糖6%，甘露醇2%，小牛血清2%，还原性谷胱甘肽1%，余量为ph7.5的pbs缓冲液。77、本实施例的保存方法，包括以下步骤：78、s1、以制备例4的方法，分离、提取茶干细胞；79、s2、将步骤s1分离、提取的茶干细胞，用pbs清洗1次，离心沉淀，得到清洗后的茶干细胞；80、s3、配置冻存液，将步骤s2得到的清洗后的茶干细胞接种至冻存液中，重悬，制得重悬液，接种密度1×106个/ml；81、s4、将步骤s3制得的重悬液，在0℃温度下培养4h；而后以5℃/min的降温速率，降温至-35℃预冻2h；再而后以10℃/min的降温速率，降温至-80℃冷冻4h，最后移至液氮中冻存保存。82、实施例83、本实施例的冻存液各组分质量分数配比为：基础培养基44%，聚天冬氨酸4%，聚乙烯吡咯烷酮2%，海藻糖7%，甘露醇2.5%，小牛血清2%，还原性谷胱甘肽2%，余量为ph7.4的pbs缓冲液。84、本实施例的保存方法，包括以下步骤：85、s1、以制备例4的方法，分离、提取茶干细胞；86、s2、将步骤s1分离、提取的茶干细胞，用pbs清洗，离心沉淀，得到清洗后的茶干细胞；87、s3、配置冻存液，将步骤s2得到的清洗后的茶干细胞接种至冻存液中，重悬，制得重悬液，接种密度1×106个/ml；88、s4、将步骤s3制得的重悬液，在0℃温度下培养4h；而后以5℃/min的降温速率，降温至-35℃预冻2h；再而后以10℃/min的降温速率，降温至-80℃冷冻4h，最后移至液氮中冻存保存。89、实施例90、本实施例的冻存液各组分质量分数配比为：基础培养基46%，聚天冬氨酸6%，聚乙烯吡咯烷酮3%，海藻糖8%，甘露醇3%，小牛血清3%，还原性谷胱甘肽3%，余量为ph7.4的pbs缓冲液。91、本实施例的保存方法，包括以下步骤：92、s1、以制备例4的方法，分离、提取茶干细胞；93、s2、将步骤s1分离、提取的茶干细胞，用pbs清洗，离心沉淀，得到清洗后的茶干细胞；94、s3、配置冻存液，将步骤s2得到的清洗后的茶干细胞接种至冻存液中，重悬，制得重悬液，接种密度1×106个/ml；95、s4、将步骤s3制得的重悬液，在0℃温度下培养4h；而后以5℃/min的降温速率，降温至-35℃预冻2h；再而后以10℃/min的降温速率，降温至-80℃冷冻4h，最后移至液氮中冻存保存。96、实施例97、本实施例与实施例3的区别在于，本实施例的步骤s2中，用pbs清洗，离心沉淀的步骤，重复1次。98、实施例99、本实施例与实施例3的区别在于，本实施例的步骤s2中，用pbs清洗，离心沉淀的步骤，重复2次。100、实施例101、本实施例与实施例6的区别在于，本实施例的步骤s3中，接种密度控制在1×107个/ml。102、实施例103、本实施例与实施例6的区别在于，本实施例的步骤s3中，接种密度控制在1×108个/ml。104、实施例105、本实施例与实施例6的区别在于，本实施例的步骤s3中，接种密度控制在1×109个/ml。106、实施例107、本实施例与实施例8的区别在于，本实施例的步骤s4中，在4℃温度下培养8h。108、实施例109、本实施例与实施例8的区别在于，本实施例的步骤s4中，在4℃温度下培养7h。110、实施例111、本实施例与实施例10的区别在于，本实施例的步骤s4中，降温至-35℃的降温速率控制在4℃/min；本实施例的步骤s4中，降温至-80℃以下的降温速率控制在6℃/min。112、实施例113、本实施例与实施例8的区别在于，在2℃温度下培养7h；而后以2℃/min的降温速率，降温至-30℃预冻1h；再而后以4℃/min的降温速率，降温至-80℃冷冻3h，最后移至液氮中冻存保存。114、实施例115、在3℃温度下培养8h；而后以3℃/min的降温速率，降温至-30℃预冻2h；再而后以5℃/min的降温速率，降温至-80℃冷冻4h，最后移至液氮中冻存保存。116、对本技术实施例1~15的冻存方法，冻存的茶干细胞3个月，而后进行复苏，而后检测复苏后的细胞活率，具体结果见下表1，检测数据四舍五入取0.1%精度。117、表1 实施例1~15细胞活率检测结果118、 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 实施例7 活率 82.3% 82.1% 83.8% 83.4% 84.5% 85.2% 85.3% 实施例8 实施例9 实施例10 实施例11 实施例12 实施例13 实施例14 活率 85.1% 84.2% 87.5% 87.7% 91.2% 96.4% 96.6% 119、通过表1的数据可以看出，本技术的冷冻保存方法，保存茶干细胞，复苏后的活率能够达到80%以上，具有极为优异的保存效果。120、通过表1的数据可以看出，本技术实施例1~4中，实施例3的保存效果最为优异，可见采用实施例3的冻存液，对茶干细胞的冻存效果最优。121、通过表1的数据，本技术实施例5~14对比，可以看出，本技术清洗干细胞，采用多次清洗更有利于干细胞的冻存，多次清洗可以有效洗去干细胞分离、提取时附着的细胞分泌物和残留培养基；本技术冻存时，细胞接种密度控制在1×107~1×108个/ml为宜，密度过高会降低细胞冻存的活率；本技术采用特定的冻存操作步骤，更有利于细胞活性的维持，特定的低温适应性培养，配合逐步降温的冷冻步骤，可以有效保证了茶干细胞在低温冻存下的活性。122、以上均为本技术的较佳实施例，并非依此限制本技术的保护范围，故：凡依本技术的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本技术的保护范围之内。