一种PDLSC膜片非冻结式低温运输方法及培养基

本发明属于细胞保存，具体涉及一种pdlsc膜片非冻结式低温运输方法及培养基。背景技术：1、组织工程是一种自20世纪80年代以来再生病理损伤组织，如骨、脊髓等的方法。细胞膜片技术(cell sheet technology，cst)作为传统组织工程的一种替代方法，它不受支架的限制，主要由细胞间连接的形成和细胞外基质(extracellular matrix，ecm)蛋白的分泌来维持。由于采集细胞膜片时未经过蛋白水解酶处理，细胞间的相互作用和细胞膜片结构得以很好地保存，细胞膜片具有更高的细胞浓度和更均匀的细胞分布，没有支架材料的免疫干扰，从而提高了再生能力。临床和实验研究已经将细胞膜片技术应用于许多组织和器官，如心肌、视网膜、骨骼、牙周再生等领域。细胞膜片技术作为一种广泛应用于再生医学的新型细胞治疗方法，正成为医学研究的热点。2、pdlscs是2004年被seo首次分离出的一种独特的细胞群，具有高度更新能力、高度增殖能力、多向分化能力且容易获得而作为牙周组织工程的常用种子细胞。pdlscs是一种异质性多能干细胞，可以分化为成骨细胞、成纤维细胞、成牙骨质细胞，形成牙槽骨、牙周纤维、牙骨质结构，这些结构形成的功能性牙周复合体对牙周重建有重要意义。已有多项研究使用pdlscs膜片成功进行了牙周组织的再生，也有临床研究报道将自体牙周膜干细胞制备成细胞膜片后移植至牙周缺损区域6个月后发现牙周探诊深度减少，附着水平增加，cbct显示骨密度增加。3、然而，细胞膜片在实验室制备运送到临床是一个耗时、复杂的过程，导致细胞膜片的临床应用受到了限制。通常情况下使用传统方法，在实验室中培养细胞膜片至少需要10天，从gmp设施将产品运输至医疗机构给药之间可能经过很长时间，而细胞制品的一个显著特点是随着时间的推移其稳定性降低，所以维持稳定性对于安全有效地实施细胞疗法至关重要。4、大量体外研究表明，细胞储存条件会导致细胞形态、活力和治疗效力的改变，低温存储作为一种长期保存各种生物材料的方法，在卵母细胞、干细胞、血管组织和胚胎中已被广泛研究。目前对pdlscs细胞样本进行低温存储运输大多采用液氮、冻存剂冻存、干冰冷冻等方式进行，其中，使用最多的是液氮-196℃冷冻保存，但使用液氮-196°冻存，就意味着不能通过飞机、高铁来运输，若选择汽车运输，时间长液氮挥发，细胞活力就会受到很大的影响，严重制约了干细胞在临床上的应用。而冻存剂虽然能够在一定程度上避免冷冻保存溶质损伤以及在降/复温过程中胞内冰晶的形成，如二甲基亚砜(dmso)等冻存剂，但dmso表现出细胞毒性等副作用，特别是在浓度超过40％(5.1m)时。并且，冻存剂在非冻结状态下的低温保存(2-8℃)在长时间运输后仍然会导致活细胞数量死亡量大幅度提升。因此，就需要有一种有效的短期细胞储存方法，以便能保证质量地运送到临床进行治疗。技术实现思路1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种pdlsc膜片非冻结式低温运输方法及培养基，能够使pdlsc膜片在4℃下进行运输，并保证细胞活性。2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：3、一种pdlsc膜片非冻结式低温运输方法，对hpdlscs进行接种培养，然后采用培养基培养10～14天，形成细胞膜片，然后置于含血清的覆有滤膜透气孔的运输瓶中4℃运输；4、培养基包括10％胎牛血清dmem、谷氨酰胺、青霉素、链霉素以及抗坏血酸。5、进一步地，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.1～0.5mg/ml、青霉素终浓度为100～200u/ml、链霉素终浓度为50～200μg/ml、抗坏血酸终浓度为50～150μg/ml。6、进一步地，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.1～0.3mg/ml、青霉素终浓度为100～120u/ml、链霉素终浓度为50～130μg/ml、抗坏血酸终浓度为50～80μg/ml。7、进一步地，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.292mg/ml、青霉素终浓度为100u/ml、链霉素终浓度为100μg/ml、抗坏血酸终浓度为50μg/ml。8、进一步地，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.3mg/ml、青霉素终浓度为105u/ml、链霉素终浓度为110μg/ml、抗坏血酸终浓度为60μg/ml。9、进一步地，采用培养基进行培养的条件为：37℃、5％ co2恒温培养箱中培养。10、一种使pdlsc膜片可进行非冻结式低温运输的培养基，包括10％胎牛血清dmem，以及终浓度为0.1～0.5mg/ml的谷氨酰胺、终浓度为100～200u/ml的青霉素、终浓度为50～200μg/ml的链霉素和终浓度为50～150μg/ml的抗坏血酸。11、进一步地，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.292mg/ml、青霉素终浓度为100u/ml、链霉素终浓度为100μg/ml、抗坏血酸终浓度为50μg/ml。12、进一步地，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.3mg/ml、青霉素终浓度为105u/ml、链霉素终浓度为110μg/ml、抗坏血酸终浓度为60μg/ml。13、本发明的有益效果：14、hpdlscs膜片在4℃冷链运输条件下保存0d-3d。15、本发明的有益效果为：16、本发明提供了一种便捷、有效的细胞膜片运输方式，能在0～4℃冷链运输的条件下保存干细胞膜片0～3天，无需进行超低温冻存处理，操作简单方便，对保存运输设备的要求低，在0～4℃的条件下可保存运输，可采用常规的长途运输。且细胞膜片的增殖分化能力、成骨、成牙骨质和成牙周膜能力与新鲜制备的膜片无显著差异。在运输结束后，在室温环境中，从细胞保温运输箱中取出运输瓶，解封，恢复至室温可直接使用于临床。技术特征：1.一种pdlsc膜片非冻结式低温运输方法，其特征在于，对hpdlscs进行接种传代培养，然后采用培养基继续培养10～14天，形成细胞膜片，最后置于含血清的覆有滤膜透气孔的运输瓶中4℃运输；2.根据权利要求1所述的pdlsc膜片非冻结式低温运输方法，其特征在于，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.1～0.5mg/ml、青霉素终浓度为100～200u/ml、链霉素终浓度为50～200μg/ml、抗坏血酸终浓度为50～150μg/ml。3.根据权利要求2所述的pdlsc膜片非冻结式低温运输方法，其特征在于，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.1～0.3mg/ml、青霉素终浓度为100～120u/ml、链霉素终浓度为50～130μg/ml、抗坏血酸终浓度为50～80μg/ml。4.根据权利要求3所述的pdlsc膜片非冻结式低温运输方法，其特征在于，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.292mg/ml、青霉素终浓度为100u/ml、链霉素终浓度为100μg/ml、抗坏血酸终浓度为50μg/ml。5.根据权利要求3所述的pdlsc膜片非冻结式低温运输方法，其特征在于，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.3mg/ml、青霉素终浓度为105u/ml、链霉素终浓度为110μg/ml、抗坏血酸终浓度为60μg/ml。6.根据权利要求1所述的pdlsc膜片非冻结式低温运输方法，其特征在于，采用培养基进行继续培养的条件为：放置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养。7.一种使pdlsc膜片可进行非冻结式低温运输的培养基，其特征在于，包括10％胎牛血清dmem，以及终浓度为0.1～0.5mg/ml的谷氨酰胺、终浓度为100～200u/ml的青霉素、终浓度为50～200μg/ml的链霉素和终浓度为50～150μg/ml的抗坏血酸。8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.292mg/ml、青霉素终浓度为100u/ml、链霉素终浓度为100μg/ml、抗坏血酸终浓度为50μg/ml。9.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，培养基中谷氨酰胺终浓度为0.3mg/ml、青霉素终浓度为105u/ml、链霉素终浓度为110μg/ml、抗坏血酸终浓度为60μg/ml。技术总结本发明公开了一种PDLSC膜片非冻结式低温运输方法及培养基，属于细胞保存技术领域。具体如下：对hPDLSCs进行接种培养，然后采用培养基培养10～14天，形成细胞膜片，然后置于含血清的覆有滤膜透气孔的运输瓶中，于4℃冷链温度下运输。本发明提供了一种便捷、有效的细胞膜片运输方式，能在0～4℃冷链运输的条件下保存干细胞膜片0～3天，无需进行超低温冻存处理，操作简单方便，对保存运输设备的要求低，可采用常规的长途运输，且细胞膜片的增殖分化能力、成骨、成牙骨质和成牙周膜能力与新鲜制备的膜片无显著差异。在运输结束后，在室温环境中，从细胞保温运输箱中取出运输瓶，解封，恢复至室温可直接使用于临床。技术研发人员：黄国宾,杨禾丰,彭艺,李文馨,胡瑜,杨荣强,代自超受保护的技术使用者：昆明医科大学附属口腔医院技术研发日：技术公布日：2024/3/31