提高无子刺梨组培苗中黄酮类化合物含量的方法

本技术涉及无子刺梨培育，特别是一种提高无子刺梨组培苗中黄酮类化合物含量的方法。背景技术：1、无子刺梨(rosa sterilis s.d.shi)为蔷薇科蔷薇属多年生攀援小灌木，别名金刺梨、无籽刺梨和搭钩刺梨等。无子刺梨是1954年当地村民在贵州省兴义市兴仁县回龙镇狮子村云盘山上采挖草药时发现。20世纪80年代初被引种到原贵州农学院和贵州植物园，经过栽培繁殖驯化后，1985年贵州省植物园时圣德先生将其正式定名为无子刺梨，属蔷薇属植物新种。2015年10月，国家林业局2015第18号公告正式授予植物新品种权。2、无子刺梨果实的总黄酮含量明显高于传统水果刺梨(r.roxburghii)，同时无子刺梨还富含萜类化合物、多糖、超氧化物歧化酶、维生素和矿物质元素等，无子刺梨果实还具有较强的抗氧化活性和降血糖活性，且果实香气浓郁，风味独特，大多数胚珠不育、无种子或带少数败育种子，相比传统水果刺梨更利于生产加工利用，具有更好的开发利用前景。3、无子刺梨属分布范围窄的野生资源，自然资源稀少，现有无子刺梨只能通过传统扦插方法进行种苗繁育，其扩繁速度相对较慢，繁育过程中易受多因素制约。4、黄酮类化合物是植物次生代谢产物中一类具有较强药理活性的酚类物质。目前生产黄酮类化合物的方法在很大程度上依赖于植物提取，植物生长周期长、次生代谢产物累积缓慢、气候条件不利、种植面积小、栽培困难和植物种类变化等都会影响植物产量，同时植物中所含黄酮类化合物浓度相对较低，提取过程中易损失，提取产量受到限制，严重制约了黄酮类化合物植物来源的大规模生产和应用。5、无子刺梨作为黄酮类化合物的重要来源，现有研究主要集中于无子刺梨果实中总黄酮提取方法、总黄酮检测方法等领域，并未对无子刺梨组培苗中总黄酮含量提出可行的解决方法。无法进一步提高现有无子刺梨组培苗中总黄酮的含量，制约了无子刺梨组培苗作为黄酮类物质的提取原料使用。6、公开于背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域普通技术人员所公知的现有技术。技术实现思路1、本技术针对上述技术问题提供了一种提高无子刺梨组培苗中黄酮类化合物含量的方法，该方法培育所得无子刺梨具有繁殖速度快、生长周期短、黄酮类代谢物含量高的特点，所用该组织培养系能有效提高所得无子刺梨组培苗中次生代谢产物的含量，有利于实现从无子刺梨组培苗中提取黄酮类化合物，以满足市场对黄酮类物质的巨大需求。2、本技术提供了一种提高无子刺梨组培苗中黄酮类化合物含量的方法，包括以下步骤：3、从无子刺梨植株上获取当年生的幼嫩茎段作为外植体，通过初代启动培养，继代增殖培养后，选取生长健壮的组培苗进行继代培养，所得无子刺梨组培苗的叶片和茎中黄酮类物质含量大于40mg/g；4、继代培养所用培养基以ms为基本培养基，添加0.1～1.0mg/l 6-ba和0.01～0.5mg/l naa，以及无子刺梨两年生以上枝条或叶片的干燥粉末0.1～5.0g/l，调节培养基ph值为5.0～6.0；5、继代培养条件为在26～30℃下，光照强度2000～2500lx，有光照：无光照时间比为12～14h:12～10h，培养65～75天。6、优选地，所述干燥粉末制备方法为：取无子刺梨两年生以上枝条或叶片，置于40～50℃烘箱烘干至恒重，粉碎过40目筛后得到干燥粉末。7、优选地，继代培养所用培养基还包括：凝胶剂、蔗糖、水。8、优选地，凝胶剂为琼脂，琼脂在继代培养基中的终浓度为5～6g/l。9、优选地，蔗糖为食用白糖，白糖在继代培养基中的终浓度为25～30g/l。10、优选地，采用1mol/l naoh或hcl调节培养基的ph值。11、优选地，继代培养基的灭菌条件为：121℃、101kpa下灭菌20min。12、优选地，还包括：对继代增殖培养后所得组培苗进行生根培养；13、优选地，生根培养所用生根培养基包括：ms+无子刺梨总糖提取物0.1～1.0mg/l；生根培养条件为：温度26～30℃下，光照强度1500～1800lx，光照周期比为光照时间：无光照时间为10～12h:14～12h。通过对所得组培苗进行生根培养能进一步提高所得组培苗中黄酮类化合物的含量。14、优选地，初代启动培养为将当年生的幼嫩茎段经过清洗、消毒、漂洗后，切成带1～3个叶腋的茎段，以叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基上进行诱导培养得到腋芽；15、优选地，腋芽诱导培养基包括：ms+6-ba 0.1～2.0mg/l+naa 0.1～0.5mg/l；16、优选地，培养条件：温度为26～30℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比为光照时间：无光照时间为12～14h:12～10h，诱导培养25～30d；17、优选地，继代增殖培养为：待初代启动培养所得腋芽上，诱导出的腋芽长成3cm以上的组培苗后，将其切成带1～3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行增殖培养30～35d，得到无子刺梨组培苗；18、优选地，所用腋芽增殖培养基包括：ms+6-ba 0.1～2.0mg/l+naa 0.01～0.2mg/l，19、优选地，增殖培养条件为：温度为26～30℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比为光照时间：无光照时间为12～14h:12～10h。20、具体地，初代启动培养，继代增殖培养，生根培养包括以下步骤：21、(1)腋芽诱导的启动培养22、在健壮的无子刺梨植株上获取当年生的幼嫩茎段作为外植体，外植体剪除叶片剪成2～4cm长的茎段，用洗洁精水快速冲洗5～10min，流水冲洗30～60min后置于超净工作台中，消毒采用75％酒精浸泡10～30s，0.1％升汞浸泡5～10min，消毒后用无菌水漂洗4～5次，切成带1～2个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基上进行培养，腋芽诱导培养基为：ms+0.5mg/l 6-ba+0.1mg/l naa，其中白糖30g/l，琼脂5g/l，ph5.5；培养温度为28±2℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比中光照时间：无光照时间为14h:10h。诱导25d后，芽诱导率为96％。23、(2)腋芽的增殖培养24、待诱导出的腋芽长成3cm以上的小苗后，将其切成带1～3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行培养，腋芽增殖培养基为：ms+1.0mg/l 6-ba+0.01mg/lnaa，其中白糖30g/l，琼脂5g/l，ph5.5；培养温度为28±2℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比12h:12h。30d后，小苗可长至3～4cm高，同时在叶腋处可诱导出新的不定芽小苗，反复将3～4cm高的小苗切成带1～3个叶腋的茎段转到相同的腋芽增殖培养基上进行增殖培养，可以使得无子刺梨进行大量快速的扩繁，其增殖系数为3。25、(3)无子刺梨组培苗的生根诱导26、将生长健壮的无子刺梨组培苗转移至生根培养基中，生根培养基为：ms+无子刺梨总糖提取物0.2mg/l，其中白糖30g/l，琼脂5g/l，ph5.5；培养温度26±2℃，光照强度1500～1800lx，光照周期比10h:14h。培养15d后，组培苗即可生长出数条根系，生根率为94％。27、步骤(3)中所用无子刺梨总糖提取物的制备方法，将无子刺梨果实洗净自然晾干后置于50℃烘箱烘干至恒重，粉碎过40目筛后备用。取适量无子刺梨粉末，按料液比25:1ml/g加入蒸馏水和3％的纤维素酶，在50℃恒温水浴锅中酶解40min，在超声温度为50℃，超声功率为60％(300w)的条件下提取40min，结束后抽滤去上清液。所得上清液用ab-8型大孔树脂纯化，收集过滤液体并通过旋转蒸发仪浓缩，浓缩液按1:4的比例加入95％乙醇，置于4℃冰箱醇沉12小时后，离心(5000/min，10min)取沉淀，冻干即得无子刺梨总糖提取物，提取率为15％。28、本技术能产生的有益效果包括：29、1)本技术所提供的提高无子刺梨组培苗中黄酮类化合物含量的方法，以ms培养基作为基础并在ms培养基中添加6-ba和naa，以及无子刺梨两年生以上枝条或叶片的干燥粉末作为继代培养基，显著提高无子刺梨组培苗的黄酮类代谢物含量，结合组培苗生长态势，再配合最适宜无子刺梨组培苗的生长和黄酮类代谢物生产的培养条件下，其组培苗叶片和茎段中黄酮类代谢物含量分别为仅使用ms培养条件对照组的5.29倍和4.85倍，扩大了获取高含量黄酮类代谢物的无子刺梨材料途径。30、2)本技术所提供的提高无子刺梨组培苗中黄酮类化合物含量的方法，所用培养基的原料价格低廉，来源广泛，植物生长调节剂配比简单，便于操作，为通过调节植物生长调节剂配比控制组培苗次生代谢产物量提供实验支持。通过6-ba和naa，以及无子刺梨枝条或叶片的干燥粉末的添加，使无子刺梨组培苗黄酮类代谢物的含量得到明显提高。31、3)本技术所提供的提高无子刺梨组培苗中黄酮类化合物含量的方法，该方法从无子刺梨组培苗不断诱导扩繁，不经脱分化和再分化，培养周期短，遗传性状稳定，芽苗健壮，培养过程简单，另一方面，经紫外分光光度计检测发现无子刺梨组培苗中含有高含量的黄酮类代谢物，对于该资源的保护和可持续利用具有重要意义。