一种膜性肾病动物模型建立方法的优化

本发明涉及实验动物，尤其是一种膜性肾病动物模型建立方法的优化。背景技术：1、膜性肾病（membranous nephropathy，mn)）是一种靶抗原与抗体结合形成免疫复合物后沉积于肾小球引起的一种自身免疫性疾病，是成人肾病综合征常见的病因，病理特征为肾小球基底膜脏层上皮细胞下免疫复合物弥漫性沉积，基底膜弥漫性增厚伴钉突形成。据统计，该疾病约1/3的患者未经药物治疗即自发缓解，其余患者对症治疗后，病情进展缓慢，但仍有30%~40%患者在起病后5至15年内进展至终末期肾脏病，甚至死亡。目前，mn的发病机制尚不清楚且非常复杂，是靶抗原、自身抗体、补体及环境因素等多因素作用的结果。随着m型磷脂酶a2受体（m-type phospholipase a2 receptor，pla2r）与1型血小板反应蛋白7a域（thrombospondin domain-containing 7a，thsd7a）等自身抗原的发现，普遍认为该病发病机制为循环/原位免疫复合物形成后，激活补体形成膜攻击复合物，从而导致足细胞损伤，最终引起蛋白尿的过程。2、体外动物模型是研究疾病发生发展及病理生理特点的一大手段，人们可以通过构建动物模型的方式，应用科学方法，从研究疾病动物模型找出疾病病因及发病机制。小鼠作为常用的动物模型之一，被广泛应用于各种疾病的研究。早在1959年，heymann等学者首次将小鼠均质化近端肾小管上皮细胞刷状缘提取物注射入小鼠体内，研制出heymann肾炎模型，在heymann肾炎中，足细胞足突靶向循环抗内吞受体巨蛋白，使得上皮下免疫沉积物激活补体，形成膜攻击复合物导致足细胞损伤和蛋白尿，但该模型的主要抗原为鼠足细胞中的巨蛋白，并非人mn的致病抗原，难以完全模拟人mn致病机理。2004年国内学者开发了阳离子牛血清白蛋白诱导的mn小鼠模型，通过尾静脉向小鼠注射不同剂量的阳离子牛血清白蛋白，高剂量组小鼠表现为低白蛋白血症、高胆固醇血症和严重蛋白尿，肾脏病理组织表现出致密的上皮下沉积物和弥漫性基底膜增厚，因此该模型与人类mn相似，但因其需要长期尾静脉注射，其小鼠死亡率高，该模型造模困难，可重复性低，稳定性较差，此外仅有高剂量组小鼠出现了典型的mn改变，该模型具有抗原剂量依赖性。assmann等将针对小鼠氨肽酶a的单克隆抗体注射到正常小鼠体内，此法虽可产生蛋白尿但持续时间短，且肾脏病理组织在光学显微镜下无显著肾小球病变，未发现补体系统的激活。因此，这些动物模型均存在不足，仍需进一步改进。3、通过检索文献，尚未发现有关抗thsd7a抗体诱导mn动物模型的专利，但国外学者已研制出抗thsd7a抗体诱发小鼠mn的动物模型，通过向小鼠注射抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者的全血清诱发小鼠发生免疫反应，产生特异性抗体，临床表现上见快速且持续的蛋白尿，肾脏组织可见足突融合及c3沉积等典型病理改变。但注射纯化后的抗thsd7a抗体小鼠只能产生一过性蛋白尿，并随抗体的消耗疾病逐渐自愈。目前thsd7a相关膜性肾病小鼠动物模型的制备只能使用患者全血清注射，若血清抗thsd7a抗体滴度较低，可能会导致该模型的病理改变不显著，甚至难以诱导典型的mn发生，不能满足研究需求，而单次注射量过大又会可能增加小鼠的死亡风险，模型失败率高。技术实现思路1、本发明的目的是提供一种thsd7a相关膜性肾病动物模型建议方法的优化。首次提出通过2次重复腹腔注射抗thsd7a抗体阳性的膜性肾病患者的全血清诱导mn小鼠模型，以降低小鼠模型的死亡率，提高模型稳定性和成功率，为进一步探讨膜性肾病发病机制提供了有利条件。该发明使用抗thsd7a抗体阳性mn患者的全血清构建了mn动物模型，证明了人抗thsd7a抗体诱导mn动物模型的可行性，扩大了抗thsd7a相关mn动物模型的应用前景。2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。3、本发明提供了一种膜性肾病动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：选取啮齿动物作为动物模型，在造模期间重复腹腔注射抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者全血清，70天后即表现出明显的膜性肾病临床及病理特点。4、进一步地，所述啮齿动物为balb/c小鼠。5、进一步地，所述重复腹腔注射为分别于造模第1天和第15天腹腔注射抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者全血清。6、优选地，所述抗thsd7a抗体的滴度为1:100。7、优选地，所述抗thsd7a抗体的注射剂量分别为1.1ml和0.5ml。8、进一步地，上述任一项所述的方法在制备膜性肾病动物模型中的引用。9、本发明还提供了抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者的全血清在制备膜性肾病动物模型中的应用，其特征在于，分别于造模第1天和第15天腹腔注射抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者全血清。10、进一步地，所述动物模型为balb/c小鼠。11、进一步地，所述抗thsd7a抗体的滴度为1:100。12、进一步地，所述抗thsd7a抗体的注射剂量分别为1.1ml和0.5ml。13、与现有技术比，本发明的有益效果如下。14、（1）本发明首次提出通过2次重复腹腔注射抗thsd7a抗体阳性的膜性肾病患者的全血清诱导mn小鼠模型，以降低小鼠模型的死亡率，提高模型稳定性和成功率，为进一步探讨膜性肾病发病机制提供了有利条件。15、（2）本发明使用抗thsd7a抗体阳性mn患者的全血清构建了mn动物模型，证明了人抗thsd7a抗体诱导mn动物模型的可行性，扩大了抗thsd7a相关mn动物模型的应用前景。16、（3）本发明首次尝试利用重复腹腔注射抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者的全血清来诱导膜性肾病小鼠模型。通过该方法制得的动物模型稳定性好，造模时间短，造模成功率及造模效率高，且更接近人类膜性肾病的改变，用于探讨膜性肾病发病机制及筛选治疗膜性肾病的药物和疗效验证有极大实用的价值。技术特征：1.一种膜性肾病动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：选取啮齿动物作为动物模型，在造模期间重复腹腔注射抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者全血清，70天后即表现出明显的膜性肾病临床及病理特点。2.根据权利要求1所述的膜性肾病动物模型的构建方法，其特征在于：所述啮齿动物为balb/c小鼠。3.根据权利要求1所述的膜性肾病动物模型的构建方法，其特征在于：所述重复腹腔注射为分别于造模第1天和第15天腹腔注射抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者全血清。4.根据权利要求3所述的膜性肾病动物模型的构建方法，其特征在于，所述抗thsd7a抗体的滴度为1:100。5.根据权利要求3所述的膜性肾病动物模型的构建方法，其特征在于，所述抗thsd7a抗体的注射剂量分别为1.1ml和0.5ml。6.权利要求1～5任一项所述的方法在制备膜性肾病动物模型中的引用。7.抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者的全血清在制备膜性肾病动物模型中的应用，其特征在于，分别于造模第1天和第15天腹腔注射抗thsd7a抗体阳性膜性肾病患者全血清。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述动物模型为balb/c小鼠。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗thsd7a抗体的滴度为1:100。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗thsd7a抗体的注射剂量分别为1.1ml和0.5ml。技术总结本发明属于实验动物学领域，具体涉及一种THSD7A相关膜性肾病动物模型建议方法的优化，选取健康雄性Balb/c小鼠重复腹腔注射抗THSD7A抗体阳性膜性肾病患者全血清，70天后尿蛋白肌酐比显著升高，小鼠肾组织HE染色显示肾小球体积明显变大，系膜细胞数量增多，系膜基质略增生，伴球囊融合；PASM染色显示基底膜钉突形成；免疫荧光染色可见THSD7A沿基底膜颗粒状沉积，C3、IgG沿毛细血管壁外颗粒状沉积；透射电镜下基底膜增厚、足突融合及电子致密物沉积，符合膜性肾病的临床及病理特点。本发明重复性好，稳定性高，造模时间短，造模成功率及造模效率高，且建立的动物模型更理想、更符合该类疾病的临床及病理生理学改变。技术研发人员：王艳秋,徐佳奕,汪凤受保护的技术使用者：中国医科大学附属盛京医院技术研发日：技术公布日：2024/3/27