含高分子聚合血红蛋白的心肌保护停跳液及其制

本发明属于涉及医疗器械领域，具体涉及含高分子聚合血红蛋白的心肌保护停跳液及其制备方法。背景技术：1、目前常规心脏移植手术多采用心肌停跳液完成心脏停搏、在体心肌保护及供体心脏的静态保存，保存技术通常仅允许4-6小时的安全缺血时间。长时间缺氧缺血状态下，细胞水肿、胞内酸中毒、间隙水肿、缺血再灌注损伤、钙超载、内皮损伤等病理损伤在静态冷保存的过程中同时存在且互为因果，严重限制着心脏静态冷保存的效果和保存时间，也是移植后缺血再灌注损伤的重要原因之一，造成移植后并发症。因此受到供者本身(如年龄等)、保存条件及保存时间的限制，许多供体心脏不能够完全满足移植条件，导致心脏病终末期患者失去移植机会。由此可见，提高保存液的心肌保护效能、减少供体心脏的缺血缺氧时间，延长离体心脏保存时间可帮助扩大心脏供体池，提高接受心脏移植的成功率，改善移植患者预后。优化保存液、改进保存方式故而成为心脏移植领域的重要研究课题之一。2、现有技术中，心脏保存的方式分为两种：1.持续灌注；2.静态冷保存。事实上在心脏保存的最初研究阶段，维持心脏功能的方式是体外灌注血液或冷晶体保存液，但由于持续4-6小时的灌注方式伴随复杂的操作流程和高额花费一度限制了心脏持续灌注的发展，因此尽管早期就有多个实验表明持续灌注的效果要优于静态冷保存，该种保存方式很快被操作更为简单且成本较低的保存方式—静态冷保存取代。3、目前，大多数心脏移植手术采用单一的心肌保护液静态低温储存供体心脏。静态冷保存的关键因素是4-8℃的低温条件和保存液的化学组成。低温条件能够减缓细胞的能量代谢，保存液的特殊离子构成可中断线粒体的电子传递活性。人们对于可获得的广泛组成成分不同的晶体灌注液的争论，说明目前并没有理想的晶体灌注液存在。尽管保存液呈多样化，但其成分的调整总体基于以下几个原则：1.低温的工作条件以减低新陈代谢；2.满足保存环境中的细胞的物理化学稳态，以保证器官组织结构的稳定；3.尽量减少缺血再灌注损伤。根据离子组成，晶体灌注液分为细胞内液和细胞外液，细胞内液型晶体灌注液含中度至高浓度钾和低浓度钠，通过模拟细胞内液的特点来减轻低温诱导的细胞水肿。细胞外液停搏液含低到中浓度的钾和高浓度钠，以避免潜在的细胞损伤及高浓度钾相关的血管阻力增加。常规使用的心肌停跳保护液液为高钾低钠细胞内液，其保存液特色为组氨酸缓冲体系，使其具有更强的ph调节能力，有助于缓冲心脏保存过程中的酸碱度变化，为心肌细胞提供更为稳定的ph环境。同时，组氨酸也是心肌细胞无氧糖酵解的重要底物，是冷保存过程中心肌细胞的能量来源。但是，研究表明心肌停跳保护液对心肌缺血的时间非常敏感，延长冷保存时间对心肌停跳保护液保存效果的影响十分显著。此外，尽管保存液的成分构成已经考虑到减少细胞水肿、缺血再灌注损伤等因素，但基于保存液的工作条件和使用方式——静态冷保存是一个长期的器官冷缺血状态，心脏的静态冷保存过程依旧存在冷缺血导致的细胞水肿、胞内酸中毒、间隙水肿、缺血再灌注损伤、钙超载、内皮损伤诸多病理问题。4、既往针对静态低温的保存方式、围绕优化器官保存液的科学研究众多。传统理念中首先是尝试向传统保存液中添加各种类型的化学物质，主要以渗透压维持、缓冲剂、抗氧化及自由基清除为主，此外也包括一些针对相关通路的离子通道阻断剂等保护性药物。但源头因素始终是缺血缺氧本身环境，单纯干预离子通路并不能有效改善供体心脏的缺血缺氧状态，故而效果不佳。其次，面对冷保存过程中的缺氧环境，更为直接的方法是人工机械加氧，氧气以溶解氧方式存在于保存液中，但因液体氧饱和度有限，很难实现对缺氧环境的有效逆转。5、持续灌注是近来年器官移植领域研究较多的器官保存方式。机械持续灌注的主要优势在于可以维持心脏循环灌注，大幅缩短供体心脏的冷缺血时间，管路中的全血、成分血或氧合的冷晶体灌注液可有效降低供体心脏的缺血缺氧相关损伤，同时也为多种减少器官缺血再灌注损伤或修复边缘器官的药物、干细胞甚至基因治疗提供应用平台，也可在保存中及时发现解剖学异常及生理学功能紊乱等。持续灌注依据温度条件分为常温(35.5-37.5℃)持续灌注、低温(1-8℃)及亚常温(20-35.5℃)持续灌注。常温持续灌注所使用的全血或成分血及低温持续灌注所使用的氧合冷晶体可在保存过程中为心肌细胞供给氧气，维持心肌细胞atp储备。目前国际认可已进入临床使用的唯一持续灌注设备为美国transmetic公司的ocs(organ care system)heart，ocs可实现34℃条件下维持心脏跳动，减少器官冷缺血时间，规避了静态冷保存中无氧糖酵解产物堆积等一系列有害因素，同时可在灌注保存期间监测乳酸含量和部分功能包括射血分数、心室输出量及收缩力，有利于移植手术医生在移植进行前对供体进行质量评估。此外，还有4款心脏低温持续灌注设备已在动物实验中初见成效。同时，国内的机械持续灌注设备研发也紧跟国际步伐，2020年华中科技大学同济医学院附属协和医院董念国教授团队对研发中的供体心脏转运系统进行了样机阶段的大动物实验，效果显著。2021年，中山大学附属第一医院也召开新闻发布会，宣布世界首例“无缺血”心脏移植手术获得成功，术中依靠自主研发的持续灌注设备实现了全程血流不中断、心脏不停跳。足以可见国内外移植领域在心脏持续灌注研究方向的重视与努力。6、然而，心脏持续灌注也面临诸多问题：1.保存过程中，心脏长时间的有氧跳动会产生大量代谢产物，需要不断从循环管路中去掉代谢产物减少堆积，尽量降低代谢产物对器官质量及移植效果的影响；2.目前进入临床使用的ocs循环管路需要全血或成分血，除去配型、感染等风险，血液在人工管路中循环过程中极易产生血栓，对心脏保存中及移植后功能影响极大；3.操作复杂且设备维护费用高，操作持续灌注设备进行保存对体外循环医生要求较高，相比较静态冷保存其步骤也明显复杂，患者也会负担更高的移植手术费用；4.持续灌注对设备中心脏功能评估系统要求较高，无论是已经投入临床的ocs还是目前研发中的各心脏持续灌注设备，其在保存及转运中的功能评估体系均需进一步完善。因此，尽管持续灌注的效果显著优于静态冷保存，但在心脏移植中距离真正的被临床广泛接受使用仍有诸多问题需要解决。由此可见，如果可以寻求一种介于缺血缺氧的静态冷保存和复杂给氧的持续不停跳灌注保存之间的供体心脏保存形式，或可中和目前两种主流保存理念的优势，同时缓冲各自的不足。7、近年来，生物载氧治疗剂因其高效携氧释氧能力受到高度关注，与单纯在液体中高压加氧获得有限的液体溶解氧不同，生物载氧剂能够达到更高且稳定的氧饱和度，而与同样具备载氧功能的全血或成分血相比，又有无需配型、工作温度范围广(2-40摄氏度)、无凝血风险等优势。其中戊二醛聚合牛源血红蛋白为化学修饰类血红蛋白氧载体，体积为红细胞的千分之一，但载氧能力却高达红细胞的7-9倍。多项研究表明，氧合戊二醛聚合牛源血红蛋白可到达红细胞不可及的微循环末端实现有效供氧，快速恢复冠脉栓塞后的心肌供氧，减少梗死面积，维持心输出量，保护左心室功能，同时减少冠脉再通后的心肌缺血再灌注损伤，体现了其在心血管疾病应用中的研究价值。在心脏供体冷保存领域，戊二醛聚合血红蛋白的应用较少涉及。既往有研究团队利用戊二醛聚合人胎盘血来源血红蛋白进行了大鼠离体心脏冷保存研究，发现在传统保存液中添加氧合血红蛋白成分可减少心肌细胞损伤，延长体外保存时间至9-14小时，说明戊二醛聚合血红蛋白在供体心脏冷保存中具有相当可观的应用前景。8、除以上主要研究进展外，目前也有专利涉及到血红蛋白成分与现有器官保护液的组合或者与常规晶体液成分的组合，以应用于心脏外科手术中的心脏灌停及移植供体心脏保存。9、现有方案一：del nido含血停搏液，已广泛应用于临床，采用4:1含血停搏液间断灌注，携带充足的底物和氧，又具有一定的酸碱缓冲和氧自由基清除能力，心肌保护效果明显优于单纯晶体心脏停搏液，单次灌注可间隔90-120min。但del nido含血停搏液1.仅应用于停搏，不能应用于移植供体器官在转运过程中的长时间心肌保护；2.其中的血液成分在低温条件下涉及凝血、血栓、感染等一系列血液相关的风险，需要配比肝素使用。10、现有方案二:直接向现有的商品化心肌保护停跳液(如htk、st’thomas、康斯特)中添加血红蛋白成分，利用商品化心肌保护停跳液中的已有既定成分(盐离子、氨基酸等)在心脏静态冷保护过程中实现心肌细胞渗透压维持及营养供给，血红蛋白作为载氧剂可携氧供给保存过程中心肌细胞需要的氧气，其血红蛋白来源包含了多种哺乳类包括人胎盘血、牛源、猪源等。但不包含配套氧合装置。并且因其使用方式为使用前需要将血红蛋白成分按照所需浓度与商品化心肌保护停跳液进行配比，再进行体外氧合。如果应用于临床，其操作过程比较复杂，也需要培训专门的体外循环医生进行上述系列操作，应用方便性不高。11、现有方案三：含有血红蛋白成分的器官灌注液成品(202010082394.5、202010164242.x、202010332040.1)，应用方向以机械灌注为主，配方中含有葡萄糖、肝素钠等机械持续灌注液所需成分。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种心肌保护停跳液。2、本发明的再一目的在于提供上述心肌保护停跳液的制备方法。3、根据本发明具体实施方式的心肌保护停跳液，其包括以下组分：0.6-3g/dl聚合血红蛋白、氯化钠、氯化钾、2-酮戊二酸-氢-钾、六水氯化镁、一水一盐酸组氨酸、组氨酸、色氨酸、甘露醇、二水氯化钙、乙酰半胱氨酸及注射用水。4、根据本发明具体实施方式的含高分子聚合血红蛋白的心肌保护停跳液，其由以下物质组成：5、聚合血红蛋白1～20g/l；6、氯化钠0.5～10g/l；7、氯化钾0.1～10g/l；8、2-酮戊二酸-氢-钾0.1～10g/l；9、六水氯化镁0.5～10g/l；10、一水一盐酸组氨酸1～10g/l；11、组氨酸10～50g/l；12、色氨酸0.1～10g/l；13、甘露醇1～20g/l；14、二水氯化钙0.001～0.01/l；15、乙酰半胱氨酸0.5～10g/l。16、本发明提供的聚合血红蛋白具有稳定的携氧、释放氧的功能，可以改善保存过程中的缺氧条件，增加离体器官的氧气利用度，进一步减少心肌细胞无氧呼吸糖酵解的产物堆积，保护心肌功能，维持离体器官生理活性，延长保存时间。改善移植患者预后，减少缺血在灌注损伤。17、本发明将氯化钠、氯化钾、2-酮戊二酸一氢一钾和六水氯化镁进行组合，做为ph缓冲液，保持电解质平衡，维持组织细胞渗透压的盐离子浓度和维持生理环境ph稳定的缓冲液成分。18、选择一水一盐酸组氨酸、组氨酸和色氨酸，提供能量，维持组织细胞最低的生理代谢条件。19、甘露醇提高血浆渗透压，使组织脱水，防止离体器官缺氧引起的水肿。20、二水氯化钙是组织的保护剂。21、选择乙酰半胱氨酸清除组织细胞代谢过程中产生的自由基，维持细胞内的氧化还原环境，防止保存过程中细胞凋亡，以及引起的细胞内核酸降解。22、根据本发明具体实施方式的含高分子聚合血红蛋白的心肌保护停跳液，所述聚合血红蛋白由包括如下步骤的方法制备得到：23、(1)取新鲜全血，过滤除去白细胞，得到纯化红细胞，加入注射用水分裂红细胞，得到血红蛋白；24、(2)使用超滤膜，去除血红蛋白中的细胞碎片和大于100kda的蛋白，得到除杂后的血红蛋白；25、(3)超滤浓缩步骤(2)得到的血红蛋白；26、(4)使用阴离子交换柱，去除步骤(3)所得血红蛋白的杂质；27、(5)超滤浓缩步骤(4)得到的血红蛋白；28、(6)进行氮气脱氧，得到聚合前血红蛋白；29、(7)加入戊二醛溶液聚合前血红蛋白，形成聚合血红蛋白。30、根据权利要求1或2所述的含高分子聚合血红蛋白的心肌保护停跳液，其特征在于，所述聚合血红蛋白由包括如下步骤的方法制备得到：31、采集新鲜全血到含有抗凝剂的储血袋中；32、血液中的白细胞通过白细胞过滤器除去，得到纯化红细胞，加入注射用水分裂红细胞并释放血红蛋白；33、使用100kda超滤血红蛋白，去除细胞碎片和大于100kda的蛋白质；34、经30kda超滤膜浓缩；35、通过0.45和0.22μm膜，将血红蛋白过滤到无菌储液袋中；36、通过阴离子交换柱上，采用ph梯度洗脱的方式去掉血红蛋白中的杂质；37、用30kda超滤膜对血红蛋白进行浓缩；38、经过气体交换膜进行氮气脱氧后，将血红蛋白加入缓冲液中，制备得到聚合前血红蛋白；39、通过0.45和0.22μm膜，将聚合前血红蛋白过滤到无菌储液袋中；40、加入戊二醛溶液至聚合前血红蛋白中，形成聚合血红蛋白；加入硼氢化钠，进行稳定；41、通过30kda的超滤膜进行浓缩，使用his平衡液缓冲；42、通过0.45μm和0.22μm过滤器过滤至无菌储液袋中，得到聚合血红蛋白。43、根据本发明具体实施方式的含高分子聚合血红蛋白的心肌保护停跳液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：44、取各物质混合，混合后，含有：45、聚合血红蛋白1～20g/l；46、氯化钠0.5～10g/l；47、氯化钾0.1～10g/l；48、2-酮戊二酸-氢-钾0.1～10g/l；49、六水氯化镁0.5～10g/l；50、一水一盐酸组氨酸1～10g/l；51、组氨酸10～50g/l；52、色氨酸0.1～10g/l；53、甘露醇1～20g/l；54、二水氯化钙0.001～0.01/l；55、乙酰半胱氨酸0.5～10g/l。56、优选的，所述聚合血红蛋白由包括如下步骤的方法制备得到：57、(1)取新鲜全血，过滤除去白细胞，得到纯化红细胞，加入注射用水分裂红细胞，得到血红蛋白；58、(2)使用超滤膜，去除血红蛋白中的细胞碎片和大于100kda的蛋白，得到除杂后的血红蛋白；59、(3)超滤浓缩步骤(2)得到的血红蛋白；60、(4)使用阴离子交换柱，去除步骤(3)所得血红蛋白的杂质；61、(5)超滤浓缩步骤(4)得到的血红蛋白；62、(6)进行氮气脱氧，得到聚合前血红蛋白；63、(7)加入戊二醛溶液聚合前血红蛋白，形成聚合血红蛋白。64、更为优选的，所述聚合血红蛋白由包括如下步骤的方法制备得到：65、采集新鲜全血到含有抗凝剂的储血袋中；66、血液中的白细胞通过白细胞过滤器除去，得到纯化红细胞，加入注射用水分裂红细胞并释放血红蛋白；67、使用100kda超滤血红蛋白，去除细胞碎片和大于100kda的蛋白质；68、经30kda超滤膜浓缩；69、通过0.45和0.22μm膜，将血红蛋白过滤到无菌储液袋中；70、通过阴离子交换柱上，采用ph梯度洗脱的方式去掉血红蛋白中的杂质；71、用30kda超滤膜对血红蛋白进行浓缩；72、经过气体交换膜进行氮气脱氧后，将血红蛋白加入缓冲液中，制备得到聚合前血红蛋白；73、通过0.45和0.22μm膜，将聚合前血红蛋白过滤到无菌储液袋中；74、加入戊二醛溶液至聚合前血红蛋白中，形成聚合血红蛋白；加入硼氢化钠，进行稳定；75、通过30kda的超滤膜进行浓缩，使用his平衡液缓冲；76、通过0.45μm和0.22μm过滤器过滤至无菌储液袋中，得到聚合血红蛋白。77、本发明还提供上述含高分子聚合血红蛋白的心肌保护停跳液的应用，心肌保护停跳液在2～8℃下使用。78、本发明的有益效果：79、本发明提供的心肌保护停跳液，相较其他器官保护液，增加了聚合血红蛋白成分，与其他组分协同配合，使其在维持心肌细胞内外渗透压、减少细胞水肿、提供足够能量储备的前提下，保证血红蛋白构象稳定，无氧状态下高铁血红蛋白比例远低于标准，已氧合情况下高铁血红蛋白低于5％。80、本发明相对于市场上其他的器官保存液成分，将聚合血红蛋白和乙酰半胱氨酸复合使用，聚合血红蛋白为心肌组织提供所需的氧，保持离体器官生理活性；利用乙酰半胱氨酸的抗氧化、清除活性氧的作用，防止器官保存液在为离体组织供氧的过程中产生的过多的活性氧。清除组织细胞代谢过程中产生的自由基，维持细胞内的氧化还原环境，防止保存过程中细胞凋亡和炎症的发生，降低细胞内核酸降解。本发明调整成分后，渗透压仍然控制在合理范围内，调整的成分可以防止炎症的发生，进而防止细胞水肿。81、本发明提供的聚合血红蛋白能够有效进行携氧/释氧，以满足心肌维持基本生理活性的需求，聚合血红蛋白还可以提高心肌组织氧合程度并改善心脏复跳后的功能；另外，聚合血红蛋白可大大改善心脏收缩，减少梗死面积、坏死和凋亡，由tlr2和-4/nf-κb信号通路的衰减介导，聚合血红蛋白对缺血再灌注损伤具有保护作用，这种保护与no介导的心肌凋亡的衰减和亚硝基氧化还原平衡的恢复有关，并且可能降低炎症反应。82、利用体外氧合装置，可达到携氧90-95％的心肌保护停跳液，本发明配方主要成分高分子聚合血红蛋白可实现高于红细胞7-9倍的携氧释氧能力，且没有凝血、血栓、感染风险，经过氧合后可以在心脏灌停及静态冷保存过程中为心肌供给氧气，其他成分为灌停及保存中所需离子及少量代谢底物，维持心肌细胞内外渗透压，减少心肌细胞水肿。