一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻

本发明涉及一种冷冻保护液，特别是涉及一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液。背景技术：1、细胞治疗是指经生物工程改造或者体外扩大培养的“种子细胞”输入患者体内治疗疾病的新型医疗技术。细胞治疗主要包括免疫细胞治疗和干细胞治疗。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)属于成体干细胞，是干细胞治疗中主要使用的细胞种类之一。mscs细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞，具有来源丰富、低免疫原性、增殖能力强、多向分化能力、调节免疫等特性。以间充质干细胞为基础的细胞疗法在美容，保健，药物筛选以及组织损伤、免疫缺陷，以及糖尿病、退行性神经系统疾病、骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应(gvhd)、脊髓损伤等疑难杂症的研究治愈方面展现出了巨大的潜能。2、调查表明，截止到2019年，全球范围内已经有16款干细胞相关的药物上市，2024年全球干细胞治疗的市场份额将增长至1945.6亿美元。3、细胞治疗一般需要大量的优质细胞，这决定了细胞治疗的效果。临床研究表明mscs细胞数量达到1×109个时才能有效的治疗组织损伤。而人体组织当中含有的mscs细胞数量较少，要想获得大量的mscs细胞则需要在体外进行连续扩增，但是这种方法不仅会增加细胞污染的可能性，更重要的是会导致细胞老化，功能退变。为了避免连续培养对mscs细胞产生的不利影响，为细胞治疗提供数量充足、功能完好、来源一致的细胞资源，临床和基础实验研究都需要借助细胞深低温冷冻保存细胞技术。这种深低温冷冻保存细胞技术可以将细胞进行远距离的运输，确保细胞存活，避免细胞污染。细胞冻存还可以满足临床研究的一些不可预知的需求，有利于全球干细胞市场的发展。4、所谓深低温冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-170℃的超低温条件)，并在此温度下长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。利用此技术可以使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停滞，而一旦恢复正常生理温度又能继续生长发育。5、水在低于零度的条件下会结冰，如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先冻结，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。为了避免细胞内冰晶的损伤及溶质损伤，玻璃化冷冻技术应运而生。6、玻璃化冷冻法的基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下冻结，形成玻璃化状态，保存了液态时正常分子和离子分布，因而玻璃化对细胞具有保护作用。细胞在冷冻保护剂中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。玻璃化冷冻保护剂是冷冻及解冻过程中对细胞起保护作用的试剂，可有效减少细胞内外渗透压和细胞内外冰晶对细胞的损伤。冷冻保护剂根据是否能够穿透细胞膜，可分为渗透型和非渗透型两类。渗透型冷冻保护剂可渗透细胞膜、进入细胞内，并与细胞内水分相互置换，这类渗透性保护剂通常为一些富含羟基的小分子物质，如甘油(gly)、二甲基亚砜(dmso)、乙二醇(eg)、1,2－丙二醇(proh)等。非渗透型保护剂是一类富含羟基的大分子物质，因其不能够进入细胞而称之为非渗透性保护剂。非渗透性保护剂主耍通过改变细胞外渗透压，引起细胞脱水，从而减少细胞内冰晶的形成，发挥非特异性保护作用。常用的非渗透型冷冻保护剂包括单糖(如葡萄糖)、双糖(如海藻糖)、三糖(如棉花糖)、聚庶糖(ficoll)、聚乙稀吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)、白蛋白(albumin)等。7、目前常用的深低温冷冻保存mscs细胞的冷冻保护剂都含有dmso，dmso可以渗透进入mscs细胞，发挥冻存保护作用。但是dmso本身具有细胞毒性，即便细胞复温后快速清除dmso，但残留的微量dmso依然可能导致神经毒性、心血管衰竭等多种副反应。严重影响复苏后的间充质干细胞的存活率甚至(子代)安全性以及功能表达。8、目前应用于间充质干细胞深低温冷冻保存的冷冻保护剂大多含有动物源的血清，动物源血清具有成分不明确，不适用于临床大规模应用。技术实现思路1、本发明的目的是提供一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液，其为无dmso的可快速冷冻间充质干细胞的新型冻存保护剂，同时由于加了小分子化合物y-27632且控制冻存液的超低内毒素，能大大减小冻存对细胞的损伤及毒性，提高细胞的复苏活率及细胞的回收率，可用于间充质干细胞的玻璃化冷冻，生产方法简洁、高效。2、本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液，包含以下成分：3、乙二醇(v/v)15-20％；4、ficoll 70(w/v)10-15％；5、人血白蛋白(v/v)15-20％；6、人血小板裂解液(v/v)20-25％；7、蔗糖0.3m；8、rock抑制剂y-27632 5μm。9、进一步地，所述rock抑制剂y-27632，抑制细胞凋亡，用生理盐水配制浓度为5mm的储液后以1:1000的比例稀释使用。10、进一步地，所述冷冻保护液使用高糖dmem基础培养基补充剩余体积；所述ficoll70及所述蔗糖均使用高糖dmem基础培养基作为溶剂配制。11、另外，本发明还公开了一种用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：12、步骤一：高糖dmem基础培养基中加入10-15％(w/v)ficoll 70静置过夜溶解；13、步骤二：rock抑制剂y-27632用生理盐水配制浓度为5mm的储液后以1:1000的比例稀释使用；14、步骤三：将15-20％(v/v)乙二醇、15-20％(v/v)人血白蛋白、20-25％(v/v)人血小板裂解液、0.3m蔗糖以及5μm的y-27632按照比例混入溶解后的10％ ficoll 70溶液中混匀用高糖dmem基础培养基补充剩余体积。15、进一步地，所述0.3m蔗糖使用高糖dmem基础培养基作为溶剂配制。16、进一步地，所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，还包括将配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用的步骤。17、进一步地，所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：18、步骤一：高糖dmem基础培养基中加入10％(w/v)ficoll 70静置过夜溶解；19、步骤二：rock抑制剂y-27632用生理盐水配制浓度为5mm的储液后以1:1000的比例稀释使用；20、步骤三：将15％(v/v)乙二醇、15％(v/v)人血白蛋白、20％(v/v)人血小板裂解液、0.3m蔗糖以及5μm的y-27632按照比例混入溶解后的10％(w/v)ficoll 70溶液中混匀用高糖dmem基础培养基补充剩余体积；21、步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。22、更进一步地，所述的用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液的制备方法，包括以下步骤：23、步骤一：40ml高糖dmem基础培养基中加入10g ficoll 70静置过夜溶解；24、步骤二：rock抑制剂y-27632用生理盐水配制浓度为5mm的储液后以1:1000的比例稀释使用；25、步骤三：将15ml乙二醇、15ml人血白蛋白、20ml人血小板裂解液、10.269g蔗糖以及50μl的y-27632混入溶解后的40ml ficoll 70溶液中混匀用高糖dmem基础培养基补充至100ml；26、步骤四：配制好的冷冻保护液用0.45μm的滤器过滤后置于4℃保存备用。27、借由上述技术方案，本发明用于多种来源的间充质干细胞的玻璃化冷冻保护液具有下列优点：28、本发明无dmso的可快速冷冻间充质干细胞的新型冻存保护剂，同时由于加了小分子化合物y-27632(y-27632是rock抑制剂，可以有效抑制细胞凋亡)且控制冻存液的超低内毒素，能大大减小冻存对细胞的损伤及毒性，提高细胞的复苏活率以及细胞的回收率，可用于间充质干细胞的玻璃化冷冻，生产方法简洁、高效。