羊精子膜保护剂、羊精子膜保护方法及铁死亡抑

本发明属于羊精液保存，具体涉及一种羊精子膜保护剂、羊精子膜保护方法及铁死亡抑制剂作为羊精子膜保护剂的应用。背景技术：1、现代养羊业向集约化、规模化发展，优秀种公畜的缺乏成为羊生产的重要限制。精液冷冻保存技术能够长期保存精子，是提高优秀种质资源利用率的主要措施之一，为生产带来更高的经济价值。2、生物膜结构的完整性对精子十分重要，它关乎着精子的细胞间通讯、代谢、精卵融合和调节性死亡等。精子质膜含有大量的多不饱和脂肪酸，这保障了精子的膜流动性，但极易受到活性氧的攻击，特别是在冷冻保存过程中活性氧激增的情况下。3、由于精子缺乏胞质抗氧化剂，并且精子高度致密的染色质无法产生基因组抗氧化反应，故研究一种保护精子生物膜结构完整性的保护剂成为必然。目前关于精子的稀释液、保护剂的研究，大多是与精子的活力、营养物质需求、抗菌和渗透压等内容相关，而针对能够在冷冻恢复过程中保护精子，减少精子膜损伤，降低精子内活性氧水平和膜脂质过氧化水平的精子膜保护剂及保护方法的研究，至今未见报道。4、因此，现有技术中亟需一种羊精子膜保护剂及羊精子膜保护方法。技术实现思路1、本发明的第一目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种羊精子膜保护剂，以在冷冻恢复过程中保护精子，有效减少精子受到的膜损伤，保障精子活力和生物膜结构的完整率，降低精子内活性氧水平和膜脂质过氧化水平，使精子发挥正常的生理功能。2、本发明的第一目是通过以下技术方案实现的：一种羊精子膜保护剂，包括以下组分：300mmol/l tris（三羟甲基氨基甲烷）、95mmol/l柠檬酸、56mmol/l葡萄糖、34.085-170.425μg liproxstatin-1（铁死亡抑制剂）、体积分数0.02%-0.1% dmso（二甲基亚砜）、体积分数6%甘油、体积分数1%双抗、体积分数15%卵黄液及超纯水，其中liproxstatin-1溶解于dmso中，以上物质溶解于所述超纯水中。3、本发明的第二目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种羊精子膜保护方法，以以在冷冻恢复过程中保护精子，有效减少精子受到的膜损伤，保障精子活力和生物膜结构的完整率，降低精子内活性氧水平和膜脂质过氧化水平，使精子发挥正常的生理功能。4、本发明的第二目是通过以下技术方案实现的：一种羊精子膜保护方法，包括如下步骤：5、1）配制羊精子膜保护剂：取300mmol/l tris、95mmol/l柠檬酸、56mmol/l葡萄糖、34.085-170.425μg liproxstatin-1、体积分数0.02%-0.1% dmso、体积分数6%甘油、体积分数1%双抗及体积分数15%卵黄液，将liproxstatin-1溶于dmso中，将以上物质依次加入超纯水中溶解，并定容，配制成羊精子膜保护剂；通过一次性针头滤器转移到试剂瓶中密封，4℃储存；6、2）精液采集；7、3）羊精子膜保护剂稀释精液；8、4）精液冷冻。9、所述精液采集为采用假阴道采集法，全程无菌操作；完成采精后，马上竖立假阴道，避免精液倒流，将采集的新鲜精液进行 37℃保温，并送至实验室。10、所述羊精子膜保护剂稀释精液为取按无菌操作要求采集的精液，鲜精活力达到75%以上，快速直线运动在50%以上的精液供使用；取羊精子膜保护剂，使羊精子膜保护剂升温至37℃，在37℃条件下，将精液加入到羊精子膜保护剂中，精液与羊精子膜保护剂体积比1：10稀释，稀释后混匀。11、所述精液冷冻分为山羊精液冷冻和绵羊精液冷冻。12、所述山羊精液冷冻为在4℃恒温冰箱中降温2h；降温后，将精液装入0.25ml细管中，在平衡1h后，移到距离液氮面4cm处，熏蒸7min后，迅速投入到液氮中，进行冷冻保存。13、所述绵羊精液冷冻为在4℃恒温冰箱中降温4h；降温后，将精液装入0.25ml细管中，在平衡2h后，移到距离液氮面4cm处，熏蒸7min后，迅速投入到液氮中，进行冷冻保存。14、所述精液冷冻后还包括精液解冻，所述精液解冻为从液氮中取出冷冻细管后，投入到37℃水浴锅中解冻30s，待使用。15、本发明的第三目的是为了克服现有技术存在的不足，提供一种铁死亡抑制剂作为羊精子膜保护剂的应用。16、本发明的第三目是通过以下技术方案实现的：铁死亡抑制剂作为羊精子膜保护剂的应用，其特征在于：取300mmol/l tris、95mmol/l柠檬酸、56mmol/l葡萄糖、26.235-131.175μg liproxstatin-1、体积分数0.02%-0.1% dmso、体积分数6%甘油、体积分数1%双抗及体积分数15%卵黄液，将liproxstatin-1溶于dmso中，将以上物质依次加入超纯水中溶解，并定容，配制成羊精子膜保护剂；通过一次性针头滤器转移到试剂瓶中密封，4℃储存；使羊精子膜保护剂升温至37℃，在37℃条件下，将精液加入到羊精子膜保护剂中，精液与羊精子膜保护剂体积比1：10稀释，稀释后混匀；之后进行冷冻保存。17、本发明的有益效果是：本发明能够在冷冻恢复过程中保护精子，有效减少受到的膜损伤，保障精子活力和生物膜结构的完整率，降低精子内活性氧水平和膜脂质过氧化水平，使精子发挥正常的生理功能。本发明可极大的提高羊精子膜对冷冻损伤的抗性，保障精子发挥正常生理功能，可充分提高种公羊的利用率，有利于开展家畜改良育种工作。18、对比现有的常规羊精子稀释液，采用本发明的羊精子膜保护剂保存精液，在同等条件下，山羊精子活力提高57.1%，质膜完整率提高102.4%，顶体膜完整率提高26.5%，膜脂质过氧化降低31.5%，活性氧水平降低65.5%；绵羊精子活力提高30.4%，质膜完整率提高55.2%，顶体膜完整率提高37.6%，膜脂质过氧化降低50.0%，活性氧水平降低75.7%。技术特征：1.一种羊精子膜保护剂，其特征在于包括以下组分：300mmol/l tris、95mmol/l柠檬酸、56mmol/l葡萄糖、34.085-170.425μg liproxstatin-1、体积分数0.02%-0.1%dmso、体积分数6%甘油、体积分数1%双抗、体积分数15%卵黄液及超纯水，其中liproxstatin-1溶解于dmso中，以上物质溶解于所述超纯水中。2.一种羊精子膜保护方法，其特征在于包括如下步骤：3.根据权利要求2所述的羊精子膜保护方法，其特征在于：所述精液采集为采用假阴道采集法，全程无菌操作；完成采精后，马上竖立假阴道，避免精液倒流，将采集的新鲜精液进行 37℃保温，并送至实验室。4.根据权利要求2所述的羊精子膜保护方法，其特征在于：所述羊精子膜保护剂稀释精液为取按无菌操作要求采集的精液，鲜精活力达到 75%以上，快速直线运动在50%以上的精液供使用；取羊精子膜保护剂，使羊精子膜保护剂升温至37℃，在37℃条件下，将精液加入到羊精子膜保护剂中，精液与羊精子膜保护剂体积比1：10稀释，稀释后混匀。5.根据权利要求2所述的羊精子膜保护方法，其特征在于：所述精液冷冻分为山羊精液冷冻和绵羊精液冷冻。6.根据权利要求5所述的羊精子膜保护方法，其特征在于：所述山羊精液冷冻为在4℃恒温冰箱中降温2h；降温后，将精液装入0.25ml细管中，在平衡1h后，移到距离液氮面4cm处，熏蒸7min后，迅速投入到液氮中，进行冷冻保存。7.根据权利要求5所述的羊精子膜保护方法，其特征在于：所述山羊精液冷冻为在4℃恒温冰箱中降温2h；降温后，将精液装入0.25ml细管中，在平衡1h后，移到距离液氮面4cm处，熏蒸7min后，迅速投入到液氮中，进行冷冻保存。8.根据权利要求2所述的羊精子膜保护方法，其特征在于：所述精液冷冻后还包括精液解冻，所述精液解冻为从液氮中取出冷冻细管后，投入到37℃水浴锅中解冻30s，待使用。9.铁死亡抑制剂作为羊精子膜保护剂的应用，其特征在于：取300mmol/l tris、95mmol/l柠檬酸、56mmol/l葡萄糖、34.085-170.425μg liproxstatin-1、体积分数0.02%-0.1%dmso、体积分数6%甘油、体积分数1%双抗及体积分数15%卵黄液，将liproxstatin-1溶于dmso中，将以上物质依次加入超纯水中溶解，并定容，配制成羊精子膜保护剂；通过一次性针头滤器转移到试剂瓶中密封，4℃储存；使羊精子膜保护剂升温至37℃，在37℃条件下，将精液加入到羊精子膜保护剂中，精液与羊精子膜保护剂体积比1：10稀释，稀释后混匀；之后进行冷冻保存。技术总结本发明公开了一种羊精子膜保护剂、羊精子膜保护方法及铁死亡抑制剂作为羊精子膜保护剂的应用。一种羊精子膜保护剂，包括以下组分：300mmol/L Tris、95mmol/L柠檬酸、56mmol/L葡萄糖、34.085‑170.425μg Liproxstatin‑1、体积分数0.02%‑0.1%DMSO、体积分数6%甘油、体积分数1%双抗、体积分数15%卵黄液及超纯水，其中Liproxstatin‑1溶解于DMSO中，以上物质溶解于所述超纯水中。将采集到的羊精子通过本羊精子膜保护剂稀释后，冷冻后保存，解冻后使用。本发明能够在冷冻恢复过程中保护精子，减少精子膜损伤，保障精子活力，降低精子内活性氧水平和膜脂质过氧化水平。技术研发人员：张家新,海尔汗,李博渊,白雪,张健受保护的技术使用者：内蒙古农业大学技术研发日：技术公布日：2024/3/24