一种以万寿菊花药为外植体的诱导培养基及诱导

本发明涉及组织培养，尤其涉及一种以万寿菊花药为外植体的诱导培养基及诱导方法。背景技术：1、万寿菊(tageteserecta l.)是菊科万寿菊属的一年生草本植物。万寿菊花大、色艳，在园林绿化中应用广泛。同时，万寿菊花叶黄素含量高于很多植物。从万寿菊花中提取的叶黄素，在调节动物营养代谢、生长性能、肉类品质、预防动物疾病等方面也具有重要作用，已被广泛应用于禽类皮肤、脚胫和蛋黄的着色。2、目前万寿菊育种主要采用大田常规育种方法，需要4-5代才能选择出纯系。万寿菊花药培养技术是利用发育到一定阶段的花药，在人工培养基上离体培养，在特定诱导条件下发生多次分裂，形成胚状体或愈伤组织，再次分化长成植株，只需80天便可获得一系列纯合种质，从中筛选单倍体种质，为双单倍体获得提供方法指导。3、前人关于万寿菊组培的研究，多以茎段、叶等为外植体进行万寿菊植株再生研究，青海大学唐道城发表了“生长调节剂对万寿菊花药培养的影响”，研究了万寿菊花药培养过程中不同生长调节剂对愈伤组织诱导和器官分化的影响，但尚无成功获得再生苗的报道。印度农业研究所(india agricultural research institute)发表了“optimisingprotocol for successful development of haploids in marigold(tagetes spp.)through in vitro androgenesis”，以万寿菊属的孔雀草花药为外植体，报道了孔雀草花药培养获得单倍体的技术方法，但万寿菊利用此方法尚未成功获得再生苗。技术实现思路1、针对现有技术存在的问题，本发明提供一种以万寿菊花药为外植体的诱导培养基及诱导方法。2、第一方面，本发明提供一种以万寿菊花药为外植体的诱导培养基。所述诱导培养基以含有琼脂的ms固体培养基为基础培养基，添加蔗糖10-15g/l、色氨酸15-20mg/l、苯丙氨酸10-15mg/l、精氨酸17-22mg/l、酪蛋白氨基酸150-200mg/l、无水天冬酰胺18-23mg/l、6-苄基嘌呤(6-ba)2-2.5mg/l、萘乙酸(naa)0.25-1mg/l、硝酸银1-3mg/l、盐酸吡哆辛1-3mg/l、盐酸硫胺素1-2mg/l、烟酸1-2mg/l、d-生物素0.01-0.05mg/l、叶酸0.01-0.03mg/l、抗坏血酸0.1-0.5mg/l和椰子汁50-100ml/l。3、其中，所述ms固体培养基组成为：硝酸钾1900mg/l、硝酸铵1650mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、硫酸镁370mg/l、氯化钙440mg/l、碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌8.6mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂7g/l。4、进一步地，所述诱导培养基的ph为5.6-6.0。5、在本发明的一些实施例中，所述椰子汁为成熟椰子的原汁。6、第二方面，本发明提供一种万寿菊花药诱导方法。7、本发明提供的诱导方法包括：获取万寿菊花药后，将花药置于本发明所述诱导培养基中，先在温度23-25℃、湿度80％-90％的条件下黑暗培养20-30天，然后将花药转移至分化培养基中，进行每天16h光照8h黑暗的培养，直至有再生苗的生成。8、本发明的万寿菊花药诱导培养方法，先采用20-30天黑暗培养，有助于诱导雄核发育进程，促使花药诱导单倍体。9、在本发明的一些实施例中，所述分化培养基组成为：以含琼脂的ms固体培养基为基础培养基，添加硝酸银1-2g/l；其ph为5.6-6.0。10、在本发明的一些实施例中，所述获取万寿菊花药包括花蕾的采集、预处理和消毒，以及花药的接种。11、在本发明的一些实施例中，所述花蕾的采集和预处理包括：选取健壮无病害万寿菊顶部花蕾，于早上9:00-10:00采取长度为12-21mm的花蕾，放于底部铺2层浸湿滤纸的烧杯中，在4℃冰箱预处理7-10天。12、在本发明的一些实施例中，所述花药的接种包括：剥取花蕾中间的管状小花，选择花药细胞在单核晚期到双核早期的花药，放于诱导培养基中。13、本发明所述诱导方法适用的万寿菊应具有管状花。14、本发明通过关键条件(诱导培养基成分、花蕾预处理天数、黑暗培养天数等)的控制，使得所述诱导方法的胚性愈伤组织诱导率高于68％，再生植株率不低于13％。15、在本发明的一些实施例中，所述万寿菊花药诱导方法包括以下步骤：16、(1)花蕾的采集和预处理：选取人工气候室种植的健壮无病害万寿菊顶部花蕾，于早上9:00-10:00采取长度为12-21mm的花蕾，放于底部铺2层浸湿滤纸的烧杯中，在4℃冰箱预处理7-10天。17、(2)花蕾的消毒：于浓度为75％的乙醇溶液中消毒处理1分钟，然后用无菌水清洗3次，彻底去除残留的乙醇。18、(3)花药的接种：将花蕾放到灭菌的滤纸上，剥取花蕾中间的管状小花，此时的小花含有5枚花药，利用游标卡尺测量小花长度，选择花药细胞在单核晚期到双核早期的花药，放于诱导培养基。19、(4)花药诱导培养：将含有花药的培养基置于人工气候箱黑暗培养20-30天，人工气候箱温度为23-25℃，湿度为80％-90％；20-30天后，将所有的花药转移至分化培养基，置于人工气候箱进行每天16h光照8h黑暗的培养，直至有再生苗的生成。20、本发明提供了一种以万寿菊花药为外植体的诱导培养基及诱导方法，通过选用特定的万寿菊花药诱导培养基，在其中添加了氨基酸和维生素等，能够有效地提高花药诱导再生苗率，同时，本发明的万寿菊花药诱导培养方法，通过先进行约20-30天的黑暗培养，有助于诱导雄核发育进程，促使花药诱导单倍体。总之，本发明能够极大提高万寿菊愈伤组织诱导率，使再生苗的数量大大提高，为利用花药培养万寿菊单倍体提供技术指导。技术特征：1.一种以万寿菊花药为外植体的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基以含有琼脂的ms固体培养基为基础培养基，添加蔗糖10-15g/l、色氨酸15-20mg/l、苯丙氨酸10-15mg/l、精氨酸17-22mg/l、酪蛋白氨基酸150-200mg/l、无水天冬酰胺18-23mg/l、6-苄基嘌呤2-2.5mg/l、萘乙酸0.25-1mg/l、硝酸银1-3mg/l、盐酸吡哆辛1-3mg/l、盐酸硫胺素1-2mg/l、烟酸1-2mg/l、d-生物素0.01-0.05mg/l、叶酸0.01-0.03mg/l、抗坏血酸0.1-0.5mg/l和椰子汁50-100ml/l。2.根据权利要求1所述的以万寿菊花药为外植体的诱导培养基，其特征在于，所述ms固体培养基组成为：硝酸钾1900mg/l、硝酸铵1650mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、硫酸镁370mg/l、氯化钙440mg/l、碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌8.6mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂7g/l。3.根据权利要求1所述的以万寿菊花药为外植体的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基的ph为5.6-6.0。4.根据权利要求1所述的以万寿菊花药为外植体的诱导培养基，其特征在于，所述椰子汁为成熟椰子的原汁。5.一种万寿菊花药诱导方法，其特征在于，包括：获取万寿菊花药后，将花药置于权利要求1-4任一项所述的诱导培养基中，先在温度23-25℃、湿度80％-90％的条件下黑暗培养20-30天，然后将花药转移至分化培养基中，进行每天16h光照8h黑暗的培养，直至有再生苗的生成。6.根据权利要求5所述的万寿菊花药诱导方法，其特征在于，所述分化培养基组成为：以含有琼脂的ms固体培养基为基础培养基，添加硝酸银1-2g/l；其ph为5.6-6.0。7.根据权利要求5所述的万寿菊花药诱导方法，其特征在于，所述获取万寿菊花药包括花蕾的采集、预处理和消毒，以及花药的接种。8.根据权利要求7所述的万寿菊花药诱导方法，其特征在于，所述花蕾的采集和预处理包括：选取健壮无病害万寿菊顶部花蕾，于早上9:00-10:00采取长度为12-21mm的花蕾，放于底部铺2层浸湿滤纸的烧杯中，在4℃冰箱预处理7-10天；9.根据权利要求5-8任一项所述的万寿菊花药诱导方法，其特征在于，所述诱导方法适用于含有管状花的万寿菊。10.根据权利要求9所述的万寿菊花药诱导方法，其特征在于，所述诱导方法的胚性愈伤组织诱导率高于68％，再生植株率不低于13％。技术总结本发明提供一种以万寿菊花药为外植体的诱导培养基及诱导方法，所述诱导培养基以含有琼脂的MS固体培养基为基础培养基，添加特定量的蔗糖、色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪蛋白氨基酸、无水天冬酰胺、6‑苄基嘌呤、萘乙酸、硝酸银、盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、烟酸、D‑生物素、叶酸、抗坏血酸和椰子汁。本发明还提供了利用此诱导培养基进行诱导培养的方法。本发明能够极大提高万寿菊愈伤组织诱导率，使再生苗的数量大大提高，为利用花药培养万寿菊单倍体提供技术指导。技术研发人员：穆京妹,吕兴娜,高伟,曹世哲,聂玲玲受保护的技术使用者：晨光生物科技集团股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/3/24