来自微生物的色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢

本发明属于基因工程领域，具体涉及到一个肠道微生物中两种酶的应用，即来自微生物的色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用。背景技术：1、胃肠道作为人体主要的消化器官，由复杂且多样的细菌和其他微生物(病毒、古生菌和真核生物等)组成，统称为“肠道微生物群”。肠道微生物群与宿主存在密切关联，他们共同进化，互惠互利。肠道微生物群对宿主的几个重要生理功能有重要影响，包括促进营养物质消化，改善肝脏代谢环境，免疫激活或免疫调节，改善神经系统信号等，其中一个关键影响是产生多种代谢产物和其他小分子，这些生物活性小分子代谢物被肠道吸收后，随即向身体其他器官发出信号，使得肠道细菌能够与免疫系统、激素系统、脑-肠轴、宿主新陈代谢以及其他功能等产生相互作用。这种微生物与宿主的交流对维持宿主健康至关重要。2、膳食来源的大多数蛋白质和肽在小肠中通常会被消化。未被小肠消化的蛋白质存在于结肠腔中，它们作为肠道微生物的可发酵底物，并经历强烈的蛋白质分解成氨基酸。结肠中的氨基酸可能会被肠道微生物进一步代谢，比如芳香族氨基酸(aaas)，包括色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)和酪氨酸(tyr)。色氨酸作为分子量最大的aaa，在胃肠道被吸收和分解，要么通过犬尿氨酸途径代谢降解，要么经肠道和大脑中的血清素途径代谢。3、芳香族氨基酸代谢的一个共同途径是通过芳香族氨基酸脱羧酶介导的脱羧反应生成胺，如c.sporogenes(梭菌芽孢杆菌)中观察到色胺的产生。另一个常见的模式是通过芳基氨基酸氨基转移酶(arat)介导的氨基转移反应，色氨酸分别转化为吲哚-3-丙酮酸(ipya)，随后可能经过氧化和还原，产生相应的乙酸衍生物如吲哚-3-乳酸(ila)和吲哚-3-丙酸(ipa)。其中参与代谢的肠道微生物包括c.caloritolerans(耐热隐球菌)、c.sporogenes(梭菌芽孢杆菌)、c.saccharolyticum(糖解链球菌)等。另外，色氨酸在肠嗜络细胞产生的色氨酸羟化酶(tph)产生5-羟基色氨酸(5-htp)，随后在单胺氧化酶(mao)的作用下产生5-羟基吲哚乙酸(5-hiaa)。4、除常见途径外，越来越多的独特细菌芳香族氨基酸转化途径被发现。本发明中，tmo和iaah作为吡咯伯克霍尔德氏菌中含有的蛋白酶，研究通过微生物合成产生新的代谢产物，对发现新的代谢途径以及新的代谢产物，从而对预防或治疗疾病具有重要意义。技术实现思路1、针对现有技术存在的上述技术问题，本申请的目的在于提供一种微生物来源的色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用。2、本发明采用的技术方案如下：3、色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用，在色氨酸2-单加氧酶tmo和吲哚乙酰胺脱氢酶iaah两种酶的共同催化作用下，将5-羟基色氨酸5-htp催化氧化为5-羟基吲哚乙酸5-hiaa。4、进一步地，所述色氨酸2-单加氧酶tmo和吲哚乙酰胺脱氢酶iaah分别按照以下方法进行制备：将具有tmo基因的pet28a-tmo质粒或者具有iaah基因的pet28a-iaah质粒转化到大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞中，得到的工程菌经发酵、诱导后，发酵液通过离心分离得到tmo或iaah酶的上清液，即为上清粗酶液；将上清粗酶液进行提纯，即得到含tmo或iaah酶的纯酶液。5、进一步地，tmo和iaah的催化实验为：以含tmo酶的纯酶液以及含iaah酶的纯酶液为催化剂，5-htp为反应底物，以1×pbs缓冲液为反应介质，于35-40℃的条件下进行催化反应，生成5-hiaa。其中，反应体系中iaah酶浓度为2.5-10μmol/l，优选为4-5μmol/l，tmo酶的摩尔浓度是iaah酶摩尔浓度的15-30:1，优选为20-25:1。6、进一步地，色氨酸2-单加氧酶tmo和吲哚乙酰胺脱氢酶iaah也可以共同构建在工程菌上作为催化剂，按照以下方法制备：7、s1：密码子优化后的tmo和iaah基因分别通过pcr两轮扩增得到大量目的片段，分别得到tmo(opti)目的片段和iaah(opti)目的片段；8、s2：用ecori和kpni快速内切酶对pprobe载体进行酶切得到pprobe目的载体，将tmo(opti)目的片段与pprobe目的载体通过同源重组转化到大肠杆菌e.coli dh5α感受态细胞得到质粒，经测序得到正确质粒pprobe-tmo(opti)；9、s3：随后用xbai和hindⅲ快速内切酶将步骤s2所得质粒进行酶切得到pprobe-tmo(opti)目的载体，将步骤s1扩增得到的iaah(opti)目的片段与所述pprobe-tmo(opti)目的载体同源重组转化到大肠杆菌e.coli dh5α感受态细胞并得到质粒，经测序得到正确质粒pprobe-tmo(opti)-iaah(opti)-flag。10、进一步地，以含色氨酸2-单加氧酶tmo和吲哚乙酰胺脱氢酶iaah的工程菌作为催化剂，5-htp为反应底物，以lb培养基为反应介质，于37℃±0.5℃的条件下进行反应，生成5-hiaa。11、本发明取得的有益效果是：12、1)本发明描述了一种微生物中的两个酶，分别为色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶，可以将底物5-htp经微生物途径转化为5-hiaa。5-hiaa作为二型糖尿病和关节炎新的生物标志物，tmo和iaah的新功能有助于解决其微生物合成途径，并为其工程化改造益生菌提供新思路。13、2)本申请通过纯化出色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶，以5-羟基色氨酸为底物，进行体外酶催化实验成功产生5-羟基吲哚乙酸，随后通过动力学试验，确定了表观动力学参数，进一步证明了以上两种酶能有效催化5-htp的氧化。另外，本发明也构建生成了表达flag标记的tmo和iaah的大肠杆菌dh5α菌株，进行菌株发酵实验，结果证明该工程菌株能够将5-htp转化为5-hiaa。14、以上两种酶新功能的发现，有利于我们从其探索5-hiaa及其中间产物对宿主生理和宿主健康的影响，并且帮助我们深入探索肠道微生物代谢产物治疗疾病的潜在方案。本发明的tmo和iaah酶的潜在肠道菌群5htp-5-hiaa代谢途径示意图参见图1。技术特征：1.来自微生物的色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用，其特征在于在色氨酸2-单加氧酶tmo和吲哚乙酰胺脱氢酶iaah两种酶的共同催化作用下，将5-羟基色氨酸5-htp催化氧化为5-羟基吲哚乙酸5-hiaa。2.如权利要求1所述的来自微生物的色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用，其特征在于所述色氨酸2-单加氧酶tmo和吲哚乙酰胺脱氢酶iaah分别按照以下方法进行制备：将具有tmo基因的pet28a-tmo质粒或者具有iaah基因的pet28a- iaah质粒转化到大肠杆菌e.coli bl21（de3）感受态细胞中，得到的工程菌经发酵、诱导后，发酵液通过离心分离得到tmo或iaah酶的上清液，即为上清粗酶液；将上清粗酶液进行提纯，即得到含tmo或iaah酶的纯酶液。3.如权利要求2所述的来自微生物的色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用，其特征在于以含tmo酶的纯酶液以及含iaah酶的纯酶液为催化剂，5-htp为反应底物，以1×pbs缓冲液为反应介质，于35-40℃的条件下进行催化反应，生成5-hiaa。4.如权利要求3所述的来自微生物的色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用，其特征在于反应体系中iaah酶浓度为2.5-10μmol/l，优选为4-5μmol/l，tmo酶的摩尔浓度是iaah酶摩尔浓度的15-30:1，优选为20-25:1。5.如权利要求1所述的来自微生物的色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用，其特征在于色氨酸2-单加氧酶tmo和吲哚乙酰胺脱氢酶iaah共同构建在工程菌上作为催化剂，按照以下方法制备：6.如权利要求5所述的来自微生物的色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用，其特征在于以含色氨酸2-单加氧酶tmo和吲哚乙酰胺脱氢酶iaah的工程菌作为催化剂，5-htp为反应底物，以lb培养基为反应介质，于37℃±0.5℃的条件下进行反应，生成5-hiaa。技术总结本发明公开了来自微生物的色氨酸2‑单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶的应用，在色氨酸2‑单加氧酶TMO和吲哚乙酰胺脱氢酶IaaH两种酶的共同催化作用下，将5‑羟基色氨酸5‑HTP催化氧化为5‑羟基吲哚乙酸5‑HIAA。本申请通过纯化出色氨酸2‑单加氧酶和吲哚乙酰胺脱氢酶，以5‑羟基色氨酸为底物，进行体外酶催化实验成功产生5‑羟基吲哚乙酸，随后通过动力学试验，进一步证明了以上两种酶能有效催化5‑HTP的氧化。本发明也构建生成表达Flag标记的TMO和IaaH的大肠杆菌DH5α菌株，进行菌株发酵实验，结果证明该工程菌株能够将5‑HTP转化为5‑HIAA。以上两种酶新功能的发现，有利于我们从其探索5‑HIAA及其中间产物对宿主生理和宿主健康的影响，并且帮助我们深入探索肠道微生物代谢产物治疗疾病的潜在方案。技术研发人员：叶邦策,蒋珊珊,周云燕受保护的技术使用者：浙江工业大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16