一种动物活体多肽自分类组装体的制备方法

本发明涉及一种动物活体多肽自分类组装体制备方法，属于生物医药领域。背景技术：1、在自然界中，生物分子之间的高保真识别使它们能够同时组装形成具有精确成分的不同明确结构。例如，碱基互补配对规则决定了dna形成双螺旋链状结构，而蛋白质界面之间的相互选择性识别作用则引导它们聚集成有序的三级或四级结构。在细胞骨架中，微管和微丝由微管蛋白和肌动蛋白通过精准的相互选择性识别组装形成高阶的蛋白结构来共同维持细胞稳态。这种分子或离子之间精确相互识别的过程称之为自分类。尽管溶液中人工设计的基于不同相互作用以及构建模块的自分类系统得到了二十多年的研究发展，但在活体体内实现合成分子的自分类组装仍然具有挑战性，阻碍了自分类组装在生物医学领域的应用。2、由动力学驱动、热力学平衡的自分类组装过程是由结构中多个单体之间的非共价相互作用所决定的，并且与单体之间的相对浓度密切相关。改变单体的摩尔比会破坏它们的自分类组装过程。通过控制单体的摩尔比例可以在细胞水平调控细胞的摄取程度，以及通过原位注射的方式在组织水平上调节单体的摄入比例，从而能够在细胞和组织水平构建稳定的自分类组装体系。然而，在大多数生物医学应用中，生物药剂都是通过静脉注射的方式进行给药。在静脉注射后，不同单体的血液运输和新陈代谢具有灵活性，从而导致单体在体内的时空分布各不相同，最终无法保证自分类组装的发生。3、基于肿瘤细胞内高水平的gsh可以实现多肽自分类组装体的肿瘤组织原位时空演变：由纳米棒演变形成具有自分类组装特性的扁平和螺旋纳米带。在自分类组装的基础上引入两个配体分子：smac肽和对甲基苯磺酰胺ts，同时作用于内质网er和凋亡抑制蛋白xiap，在肿瘤细胞内上调葡萄糖调节蛋白78(grp78)和caspase-3的表达，诱导er功能障碍和细胞凋亡，进而促进肿瘤细胞死亡。因此，构建含有双配体功能的肿瘤活体时空演变的动物活体多肽自分类组装体有望进一步拓展恶性肿瘤的治疗方案。技术实现思路1、本发明目的是通过肿瘤活体gsh响应型时空演变形成多肽自分类组装体，通过同时靶向细胞内质网以及结合凋亡抑制蛋白xiap从而达到对肿瘤的抑制作用。基于以上目的，本发明提供了一种动物活体多肽自分类组装体，同时提供了一种动物活体多肽自分类组装体的制备方法。2、本发明的技术方案为：3、一种动物活体多肽自分类组装体e3c16-ss-eiy+l4，其结构式如下：4、5、一种上述动物活体多肽自分类组装体的制备方法，制备步骤如下：6、步骤1：多肽e3c16-ss-eiy和l4的合成；7、通过常规的fmoc固相合成法合成多肽e3c16-ss-eiy和l4，具体操作是，称量rink树脂置于反应器中，加入二氯甲烷溶胀树脂，将相对于rink树脂4倍当量的fmoc保护的氨基酸、4倍当量的hatu和6倍当量的diea溶解于dmf中与树脂反应1.5h，用25％哌啶去除fmoc保护基团，待连接完毕后，脱出最后一个氨基酸的保护基团，使用切割剂将多肽e3c16-ss-eiy和l4从树脂上裂解下来；8、步骤2：通过将多肽e3c16-ss-eiy和l4共组装制备e3c16-ss-eiy+l4；9、首先使用多肽e3c16-ss-eiy和l4的冻干粉得到ph为7.4、浓度均为1.5mm的e3c16-ss-eiy和l4的多肽母液；通过90:10的体积比混合多肽e3c16-ss-eiy的母液和多肽l4的母液制备得到浓度为1.5mm的e3c16-ss-eiy+l4母液。10、本发明得到的多肽组装体e3c16-ss-eiy+l4的表征，包括临界聚集浓度、圆二色光谱、原子力显微镜、透射电子显微镜、共聚焦显微镜和转盘共聚焦超分辨显微镜的表征，详见具体实施方式。11、在一些实施方式中，本发明的多肽组装体可以与其他活性成分组合使用，例如化疗药物/光敏剂等，只要不产生其他不利的反应即可。12、本发明的优点和有益效果：13、(1)本发明采用的多肽序列具有良好的生物相容性，生物活性等优点。(2)本发明所有的反应条件非常温和，制备方法简单，操作简便。(3)本发明得到的多肽组装体能够通过gsh还原响应形貌转变实现肿瘤内质网靶向和xiap蛋白结合。(4)本发明得到的多肽组装体能够通过尾静脉注射在肿瘤活体内形成时空演变的多肽自分类组装结构。(5)本发明制备的肿瘤活体空演变的多肽自分类组装体对活体肿瘤具有良好的治疗效果，可以用于制备能够多方面调控肿瘤生理生存水平的药物或载体平台，从而拓展肿瘤治疗的新功能。14、下面将通过实例描述，阐述本发明的优点和效果。技术特征：1.一种动物活体多肽自分类组装体，该组装体为e3c16-ss-eiy+l4，其结构式如下：2.权利要求1所述的一种动物活体多肽自分类组装体的制备方法，其制备步骤如下：3.用于权利要求1所述的动物活体多肽自分类组装体的表征方法，其特征在于，得到的多肽e3c16-ss-eiy以及多肽配体l4的表征，包括临界聚集浓度、圆二色光谱、原子力显微镜、透射电子显微镜和转盘共聚焦超分辨显微镜的表征，各种表征方法如下：4.用于权利要求1所述的动物活体多肽自分类组装体的表征方法，其特征在于，得到的多肽自分类组装体e3c16-ss-eiy+l4的体外细胞毒性的表征，通过使用标准mtt测试确定e3c16-ss-eiy+l4对hela人宫颈癌细胞和huvec人脐静脉血管内皮细胞的细胞毒性，方法如下：5.用于权利要求1所述的动物活体多肽自分类组装体的表征方法，其特征在于，得到的多肽自分类组装体e3c16-ss-eiy+l4的细胞摄取的表征，通过共聚焦显微镜确定e3c16-ss-eiy+l4的细胞摄取情况，方法如下：6.用于权利要求1所述的动物活体多肽自分类组装体的表征方法，其特征在于，得到的多肽自分类组装体e3c16-ss-eiy+l4的内质网靶向的表征，通过共聚焦显微镜观察e3c16-ss-eiy+l4的内质网靶向情况，方法如下：7.用于权利要求1所述的动物活体多肽自分类组装体的表征方法，其特征在于，得到的多肽自分类组装体e3c16-ss-eiy+l4的蛋白结合亲和力的测定，通过微量热泳动仪检测多肽和xiap的结合力，方法如下：8.用于权利要求1所述的动物活体多肽自分类组装体的表征方法，其特征在于，得到的多肽自分类组装体e3c16-ss-eiy+l4调控细胞内蛋白表达的表征，通过免疫蛋白印迹的方法验证上述多肽以及对照分子调控细胞内蛋白表达的情况，方法如下：9.用于权利要求1所述的动物活体多肽自分类组装体的表征方法，其特征在于，得到的多肽自分类组装体e3c16-ss-eiy+l4的细胞自分类表征，通过转盘共聚焦超分辨显微镜观察e3c16-ss-eiy+l4的细胞自分类组装情况，方法如下：10.权利要求1所述的动物活体多肽自分类组装体在制备抗癌症药物方面的应用。技术总结本发明公开了一种动物活体多肽自分类组装体的制备方法，通过二硫键连接具有分别独立组装成螺旋或扁平的纳米带的多肽E3C16SH和SHEIY得到能够组装形成纳米棒结构、并具有GSH还原响应的多肽E3C16‑SS‑EIY。此外，在自分类组装纳米带中引入针对抗凋亡蛋白XIAP和细胞内质网的两种配体构建多肽组装体E3C16‑SS‑EIY+L4，可同时抑制XIAP表达和靶向内质网，随后激活依赖于Caspase的细胞凋亡和诱导内质网功能障碍，对GSH高表达的癌细胞产生选择性的细胞毒性。本发明自分类多肽组装体可在肿瘤组织发生GSH响应型时空组装演变，在癌细胞中产生了含量相等的两个多肽片段实现了肿瘤组织中的多肽自分类组装。具有抑制小鼠肿瘤生长的疗效，而且具有较好的生物安全性。技术研发人员：余志林,刘欣受保护的技术使用者：南开大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16