一种利用蜘蛛丝蛋白基因改良的蚕丝及利用蜘蛛

本发明涉及生物，具体涉及一种利用蜘蛛丝蛋白基因改良的蚕丝及利用蜘蛛丝蛋白基因改良蚕丝的方法。背景技术：1、蛛丝是一类由蜘蛛的纺丝腺体分泌的蛋白质纤维，被蜘蛛用于构建蛛网或巢穴、捕捉包裹猎物、制作卵鞘等功能。新蛛亚目的蜘蛛普遍能分泌6种以上的蛛丝，它们分别具有不同的功能：大壶状腺丝(masp)作为蛛网的支架和“钢筋结构”，具有高超的强度。小壶状腺丝(misp)作为蛛网上供蜘蛛休息的脚手架，在强度和延展性中取得平衡。鞭状蛛丝(flag)则会被粘附蛋白胶水用来捕捉猎物，它可以提供极高的延展性，被拉伸至数倍长度也不会轻易断裂。葡萄状腺丝(acsp)则会用来包裹被捕捉的猎物，可以提供高韧性。管状腺丝(tusp)则是蜘蛛包裹卵囊的丝线，它有很高的硬度，并且具有一定的防水特性。最后，在壶状腺蛛丝附着环境的基部，或者在大壶状腺丝丝线的连接处，缠绕着梨形丝(pysp)，它在自然界中作为蛛丝间的胶粘剂使用，具有很高韧性和高弹性的特性。2、不同的蛛丝蛋白都具有优异的性能，例如蛛丝领域中研究最多的大壶状腺丝(masp)强度可以达到1.6gpa，而韧性可以达到354mj/m-3，是凯夫拉49纤维的7倍，可应用于户外装备、防弹衣、降落伞等高拉伸力的场景。其余蛛丝也因高超的延展性、韧性、弹性等性能而备受关注。然而，因为蜘蛛食肉且同类相食的特性，非常难以开展规模化的养殖。且不同的蛛丝在蛛网上同时生产且产量各异，很难分离出不同种类的蛛丝纤维，这些限制极大的影响了蛛丝纤维的产能。近20年来，人们利用基因工程技术，可以使用大肠杆菌、酿酒酵母等微生物底盘细胞生产重组蛛丝蛋白，也可使用这些蛋白纺丝。但微生物因自身表达系统的限制，难以大量表达超过60kda的蛋白，而天然蛛丝蛋白的大小普标超过300kda。在天然丝蛋白中，一个基本常识是蛋白越大，重复区越多，其物理性能越优异。因此，这些重组表达生产的“迷你蛛丝”均无法达到和天然丝线相接近的性能，也很难规模化生产。3、家蚕(bombyx mori)是中国本土经过上万年驯化的吐丝昆虫，是具有成熟纺织工业体系且能够承载大规模丝线生产的生物。利用基因编辑技术，家蚕可以用作生产重组蛛丝蛋白的优良底盘。例如，现有技术中使用piggybac转座酶系统已经在家蚕中分别表达了大壶状腺丝(masp)、葡萄状腺丝(acsp)和梨形丝(pysp)的部分重复序列并取得纤维性能的提升。然而，这种表达方式表达的仅为小于100kda的迷你蛛丝蛋白或部分蛛丝蛋白，且最终生产的丝线是蛛丝-蚕丝共混的状态，其蛛丝含量平均小于10％。转座酶系统在基因组中随机插入蛛丝序列，使这种基因编辑的性状有丢失的风险。4、比起转座酶的不稳定性，以talen、crispr-cas9技术为代表的基因编辑工具可以精确的在家蚕基因组上进行编辑，从而产生稳定的性状。蚕丝蛋白包括一条重链(～390kda)、一条轻链(～26kda)和糖蛋白p25，其中重链和轻链以1:1的比例存在。但是由于轻链很短，对其与较长的完整蛛丝融合可能会影响蚕丝的结构，所以现有技术对于蚕丝-蛛丝融合的基因编辑技术均在蚕丝重链上完成，例如，有报道使用crispr-cas9基因编辑技术，将来源于大腹园蛛的较小的misp完整序列(5.3kb,大约170kda)插入重链序列，获得了高韧性的蛛丝材料。但是目前尚缺乏针对蚕丝轻链与蛛丝蛋白融合的相关技术。5、另外，目前以基因编辑转基因家蚕的表达重组蛛丝的研究中，主要集中在对大壶状腺丝(masp)、小壶状腺丝(misp)的研究，缺乏对梨形丝(pysp)完整表达的研究，梨形丝最早被当做一种类丝胶蛋白，近年来的表明重组梨形丝可以被制作成丝线，且比起其他类型的蛛丝具有更高的延展性(可被拉伸70％-200％)和更高的韧性。如果能生产完整的梨形丝蛋白并制作成丝线，将获得高超的力学性能。技术实现思路1、本发明的目的在于提供一种在蚕丝蛋白轻链上融合表达蜘蛛丝蛋白的改良蚕丝。本发明是采用以下的技术方案实现的：2、一种利用蜘蛛丝蛋白基因改良的蚕丝，所述利用蜘蛛丝蛋白基因改良的蚕丝包含蚕丝蛋白轻链，所述蚕丝蛋白轻链上连接有与蚕丝蛋白轻链融合表达形成的蜘蛛丝蛋白；3、所述蜘蛛丝蛋白的氨基酸序列包含具有至少一个蜘蛛丝蛋白重复单元序列的重复区序列。4、可选的，所述蜘蛛丝蛋白的氨基酸序列依次包含蜘蛛丝蛋白n端序列、具有至少一个蜘蛛丝蛋白重复单元序列的重复区序列、蜘蛛丝蛋白c端序列。5、可选的，所述蜘蛛丝蛋白为斑络新妇梨形腺丝蛋白；6、所述蜘蛛丝蛋白n端序列为seq id no.1所示的氨基酸序列，或与seq id no.1有至少90％相似度的氨基酸序列。7、所述蜘蛛丝蛋白重复单元序列为seq id no.2所示的氨基酸序列，或与seq idno.2有至少90％相似度的氨基酸序列。8、所述所述蜘蛛丝蛋白c端序列为seq id no.3所示的氨基酸序列，或与seq idno.3有至少90％相似度的氨基酸序列。9、可选的，所述重复区序列通过n端linker序列与蜘蛛丝蛋白n端序列连接；n端linker序列为seq id no.4所示的氨基酸序列，或与seq id no.4有至少90％相似度的氨基酸序列。10、所述重复区序列通过c端linker序列与蜘蛛丝蛋白c端序列连接；c端linker序列为seq id no.5所示的氨基酸序列，或与seq id no.5有至少90％相似度的氨基酸序列。11、可选的，所述蜘蛛丝蛋白的氨基酸序列为seq id no.6、seq id no.7、seq idno.8中的至少一种所示的氨基酸序列，或与seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8中的至少一种有至少90％相似度的序列。12、可选的，所述蜘蛛丝蛋白基因的核酸序列为seq id no.9、seq id no 10、seq idno.11中的至少一种所示的氨基酸序列，或与seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11中的至少一种有至少90％相似度的序列。13、一种利用蜘蛛丝蛋白基因改良蚕丝的方法，包括如下步骤：14、步骤一)在带有蚕丝蛋白轻链基因同源臂的载体上，构建用于使蚕表达蚕丝蛋白轻链-蜘蛛丝蛋白融合基因的donor dna载体；其中，所述蜘蛛丝蛋白的氨基酸序列包含具有至少一个蜘蛛丝蛋白重复单元序列的重复区序列；15、步骤二)将donor dna载体导入到蚕卵中，通过基因编辑技术将蚕卵的基因组中编码蚕丝蛋白轻链的基因编辑为蚕丝蛋白轻链-蜘蛛丝蛋白融合基因；16、步骤三)将完成基因编辑后的蚕卵孵化、筛选、培育后，获取所述利用蜘蛛丝蛋白基因改良的蚕丝。17、可选的，所述蚕丝蛋白轻链-蜘蛛丝蛋白融合基因中表达蚕丝蛋白轻链的核苷酸序列选为包含蚕丝蛋白轻链全部外显子的核苷酸序列。18、可选的，所述蚕丝蛋白轻链-蜘蛛丝蛋白融合基因中表达蚕丝蛋白轻链的核苷酸序列为去除至少一个内含子的蚕丝蛋白轻链序列。19、可选的，所述蚕丝蛋白轻链-蜘蛛丝蛋白融合基因中表达蚕丝蛋白轻链的核苷酸序列为去除全部内含子的蚕丝蛋白轻链序列；20、步骤一)中的donor dna载体的核苷酸序列依次包含轻链l1 n端序列、轻链外显子融合序列、蜘蛛丝蛋白基因序列、蚕丝轻链终止子、轻链c端同源臂；21、其中所述轻链l1n端序列如seq id no.12所示；轻链外显子融合序列如seq idno.13所示；所述蚕丝轻链终止子序列如seq id no.14所示；轻链c端同源臂序列如seq idno.15所示。22、可选的，所述步骤二)中所述步骤二)中利用第一目标位点序列和第二目标位点序列对蚕卵的基因组中编码蚕丝蛋白轻链的基因进行切割编辑；23、其中第一目标位点序列为gtaaccacataacatcaggt，第二目标位点序列为ttagaactcacatctcaagg。24、可选的，所述所述蚕丝蛋白轻链-蜘蛛丝蛋白融合基因中表达蚕丝蛋白轻链的核苷酸序列为包含全部外显子和内含子的完整蚕丝蛋白轻链序列。25、可选的，所述步骤一)中的donor dna载体的核苷酸序列依次包含l2信号肽和轻链n端序列、蜘蛛丝蛋白基因序列、蚕丝轻链3’utr序列、蚕丝轻链终止子、轻链c端同源臂序列；26、所述l2信号肽和轻链n端序列包含蚕丝蛋白轻链外显子6、蚕丝蛋白轻链内含子6、蚕丝蛋白轻链外显子7；27、所述l2信号肽和轻链n端序列如seq id no.16所示；蚕丝轻链3’utr序列如seq idno.17所示；蚕丝轻链终止子序列如seq id no.14所示；轻链c端同源臂序列如seq idno.15所示。28、可选的，所述步骤二)中利用第一目标位点序列和第二目标位点序列对蚕卵的基因组中编码蚕丝蛋白轻链的基因进行切割编辑；29、其中第一目标位点序列和第二目标位点序列相同，均为ttagaactcacatctcaagg。30、可选的，所述步骤二)中采用crispr-cas9系统进行基因编辑，通过将donor dna载体、包含第一目标位点序列和第二目标位点序列的ptarget质粒，以及用于表达cas9的pcas9质粒注射到蚕卵中进行基因编辑；31、可选的，所述donor dna载体的核苷酸序列中蚕丝轻链终止子与轻链c端同源臂序列之间还具有筛选序列；所述筛选序列包含编码荧光蛋白的核酸序列。32、可选的，所述步骤三)中将蚕卵孵化获得g0代的蚕种；饲养g0代蚕种，进行自交，收集蚕卵得到g1代蚕种，在荧光显微镜下观察蚕卵端点，选育发出荧光的卵培养；选育的蚕孵化后饲养到三龄期，在荧光显微镜下观察蚕的头部，检验是否发出荧光；取检测呈阳性的g1代蚕种培养成成虫，并进行自交，收集蚕卵得到g2代蚕种；培养g2期的蚕至成虫，并挑选阳性标记蚕自交，选育出纯合子的g3代蚕，利用g3代蚕获取利用蜘蛛丝蛋白基因改良的蚕丝。33、本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：34、本发明实现了斑络新妇梨形腺丝在家蚕丝素中的表达，实现了在蚕丝轻链上形成完整的蜘蛛丝蛋白，扩展了家蚕丝腺基因编辑的位点。这种轻链编辑家蚕可以和重链的基因编辑蚕进行杂交育种，为进一步选育和优化纤维性能提供技术支持。35、本发明可以生产出具有完整的蜘蛛梨形腺丝结构的纤维。通过对不同的长度序列进行测试，验证全长蛛丝插入对蚕丝性能的提升。本发明获得了家蚕轻链7号外显子和斑络新妇梨形腺丝的融合蛋白编织的纤维，其纤维的力学性能较对照蛛丝有极显著的提升：最终纤维的强力可达到773.10mpa，为对照的2.16倍，纤维的伸长率可达到28.17％，为对照的1.59倍，而韧性可达到对照蚕丝的3.36倍。这些性能数据已非常接近天然蛛丝的性能，极大的提升了基因编辑蚕丝的性能和适用范围。本发明创新性的将轻链的外显子融合在一起，并以此融合了斑络新妇梨形腺丝，其纤维的力学性能较对照蛛丝有极显著的提升：最终纤维的强力可达到525.60mpa，为对照的1.47倍，纤维的伸长率可达到30.78％，为对照的1.73倍，而韧性可达到对照蚕丝的2.59倍。这些性能数据表明该融合表达替换的方法也能实现蚕丝性能的大幅度提升。